1、豬流行性腹瀉（Porcine Epidemic Diarrhea英文縮寫PED）是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus英文縮寫PEDV)引起的一種豬接觸性腸道傳染疾病，該病的臨床表現(xiàn)為腹瀉，嘔吐，脫水等，其臨床特征類似于豬傳染性腸胃炎。早在1971年于英國首次爆發(fā)。豬流行性腹瀉以哺乳豬仔豬受到的危害最為嚴重，感染仔豬致死率可以達達到90％以上，潛伏期為5-8天，多發(fā)于冬季。
　　PED

2、V為冠狀病毒科冠狀病毒屬的RNA病毒，由PEDV引起的豬流行性腹瀉在我國大部分地區(qū)對養(yǎng)豬行業(yè)造成了不可估量的損失。能找出一種快速準確的診斷方法診斷出該病對預防控制豬流行性腹瀉起到重要的作用。單克隆抗體針對單一的抗體及位點高度專一，能夠準確的診斷出疫病。穩(wěn)定、高效的單克隆抗體為找到快速診斷豬流行性腹瀉方法指引方向。能找出若干快捷準確的判定方法診斷出豬流行性腹瀉病。單克隆抗體對預防、控制豬流行性腹瀉起到重要的作用。單克隆抗體對PEDV的結(jié)構(gòu)

3、功能與基因變異都有重要的指導作用。因此本研究的目的是制取高效，穩(wěn)定的單克隆抗體。試驗制備單抗從以下幾個方面入手:
　　1.PEDV單克隆抗體抗原的增殖與純化
　　單克隆抗體可以在豬病毒性感染疾病的抗原結(jié)構(gòu)功能分析，抗原變異性研究和診斷與控制中起重要作用?；趩慰寡芯慨a(chǎn)生的膠體金更可以快捷，簡便，高效的對樣品進行檢測。對PEDV的增殖與純化是能否能成功制備出PEDV的單克隆抗體的基礎(chǔ)環(huán)節(jié)。Vero細胞為用于本試驗擴增PEDV的

4、細胞。接種病毒于Vero細胞后大約36h左右即可觀察發(fā)現(xiàn)細胞病變，在Vero細胞病變到達90％時進行收集保存。反復凍融3次以上后，離心取上清液，將上清液高速離心后取沉淀，用PEG法對所收集的沉淀液進行濃縮粗提純。濃縮后即為試驗所用的免疫抗原。將純化后的樣品進行常規(guī)鑒定，利用RT-PCR和熒光定量PCR鑒定其是否具有免疫反應(yīng)原性。
　　2.PEDV單克隆抗體雜交瘤細胞株建立
　　經(jīng)方陣滴定法建立了PEDV的間接ELISA檢測方

5、法。結(jié)果顯示:包被PEDV最適工作濃度為2.0μg/ml，最佳包被溫度為4攝氏度。最佳時間為12小時。最適酶結(jié)合物稀釋液為1％BSA-PBST，辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG(酶標二抗)最適稀釋倍數(shù)為1∶4000，作用時間為30min。
　　將純化過的PEDV接種于小鼠，每隔7日再進行免疫。用間接ELISA方法對小鼠血清進行效價測定?？梢酝ㄟ^檢測大于105的小鼠血清滴度來進行細胞融合。在融合前第三天，選擇具有最高血清滴度的免疫

6、小鼠并進行增強。三天后，將小鼠脾臟免疫，脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞融合，觀察狀態(tài)。
　　3.PEDV單克隆抗體腹水的制備
　　將PEDV與PEDV-N蛋白作為篩選抗原，利用有限稀釋法對陽性雜交瘤細胞進行亞克隆，再用兩種ELISA法篩選，結(jié)果顯示:選取出3株可穩(wěn)定分泌抗PEDV病毒抗體的雜交瘤細胞株(3C10、5G8、5F4)。將陽性單克隆克隆培養(yǎng)在96孔板中并轉(zhuǎn)移到24孔細胞板中并轉(zhuǎn)移到6孔細胞板中，將陽生雜交瘤細胞轉(zhuǎn)移到

7、細胞瓶內(nèi)以擴增培養(yǎng)物。擴大培養(yǎng)過程中，應(yīng)及時凍存陽性雜交瘤細胞留做備用。通過腹水誘導法大量制備PEDV的單克隆抗體。
　　對所得PEDV單克隆抗體進行生物學鑒定，成功獲得1株可穩(wěn)定分泌PEDV抗體的雜交瘤細胞株(3C10)，單抗3C10的染色體數(shù)目與其他株相比遠遠超出許多;腹水的抗體效價為1∶7.5×104，濃度為7.55mg/ml。單抗3C10為IgG2b亞類;能夠與PEDV特異性結(jié)合，且僅與結(jié)構(gòu)蛋白N反應(yīng);穩(wěn)定性鑒定結(jié)果表明，