1、生物工程學報ChinJBiotech2009February2525(2):257262journals.im.ChineseJournalofBiotechnologyISSN10003061cjb@im.?2009InstituteofMicrobiologyCASAccepted:December32008Supptedby:NationalHighTechnologyResearchDevelopmentProgram(863P

2、rogram)(No.2006AA02A245)NationalNaturalScienceFoundationofChina(No.30771981)NaturalScienceFoundationofBeijing(No.7082070).Crespondingauth:NingGuo.Tel:861068213039Email:.國家高技術研究與發(fā)展項目(863計劃)(No.2006AA02A245)國家自然科學基金項目(No.3

3、0771981)北京市自然科學基金項目(No.7082070)資助。醫(yī)學與免疫生物技術SOX4單克隆抗體的制備及其在腫瘤細胞表達分析中的應用于鳴1穆蕊2呂明1李愛玲2郭寧11軍事醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所細胞免疫學研究室北京1008502國家生物醫(yī)學分析中心北京100850摘要:應用分子生物學技術構建了含SOX4編碼序列的原核表達載體在大腸桿菌DH5?中獲得了GSTSOX4融合蛋白的可溶性表達。應用谷胱甘肽Sepharose4B對重組蛋白

4、進行了純化利用純化的融合蛋白免疫小鼠制備了可特異性識別SOX4的單克隆抗體。通過間接ELISA法鑒定了抗體的效價為110?5Westernblotting分析證實了抗體的特異性。結果顯示該抗體可識別細胞內外源性過表達及內源性的SOX4蛋白。在培養(yǎng)細胞系、小鼠不同組織中SOX4蛋白的表達存在顯著的差異。本研究制備的SOX4單克隆抗體具有良好的特異性為進一步研究SOX4在腫瘤發(fā)生中的作用提供了重要的工具。關鍵詞:SOX4融合蛋白單克隆抗體腫

5、瘤發(fā)生PreparationofthemonoclonalantibodyagainstSOX4proteindetectionofSOX4expressionlevelindifferenttumcelllinesMingYu1RuiMu2MingL1AilingLi2NingGuo11DepartmentofMolecularImmunologyInstituteofBasicMedicalSciencesAcademyofMili

6、taryMedicalSciencesBeijing100850China2NationalCenterofBiomedicalAnalysisBeijing100850ChinaAbstract:InthepresentstudyweconstructedaprokaryoticexpressionvectcontainingSOX4proteinencodingsequences.TheGSTSOX4solubleproteinwa

7、sexpressedinEscherichiacoliDH5?purifiedbyglutathionesepharose4B.ThepurifiedrecombinantproteinwasusedtoimmunizeBalbCmicethemonoclonalantibodyagainstSOX4waspreparedbyusinghybridomatechnique.Thetiteroftheantibodywasdetermin

8、edas110?5byindirectELISA.ThespecificityoftheantibodywasverifiedbyWesternblottinganalysis.ThemonoclonalantibodyspecificallyrecognizedtheoverexpressedexogenousSOX4proteinaswellasendogenousSOX4protein.TheexpressionlevelofSO

9、X4proteinindifferentcelllinesmousetissueswasdetectedbyusingtheantibody.DifferentialexpressionoftheproteinwasdemonstratedbyWesternblotting.Thedataindicatedthattheantibodywasspecific.Theantibodycanbeusedasanimptanttoolffur

10、therexplationoftheroleofSOX4intumigenesis.2ISSN10003061CN111998QChinJBiotechFebruary252009Vol.25No.2Journals.im.PAGE分離細胞裂解液轉印至硝酸纖維素膜Westernblotting分析抗體對SOX4蛋白的識別。一抗分別采用抗Myc單克隆抗體及SOX4單克隆抗體二抗為辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgGECL顯色。1.8SOX4蛋

11、白在不同腫瘤細胞系中的表達分析檢測的細胞包括：肝癌細胞HepG2、乳腺癌細胞ZR751、MDA231和MCF7、肺癌細胞H460、結腸癌細胞HCT116、骨肉瘤細胞U2OS、人胚腎細胞HEK293及293T細胞。通過Westernblotting分析檢測SOX4蛋白在不同細胞系中的表達。1.9SOX4蛋白在不同小鼠組織和人腫瘤組織中的表達分析分別取4~6周齡BALBc小鼠的生殖腺、胸腺、腦等組織制備組織勻漿通過Westernblotti

12、ng分析檢測SOX4蛋白在小鼠不同組織中的表達。同時采集3對人肺癌及癌旁組織樣品通過Westernblotting分析檢測人癌旁及腫瘤組織中SOX4蛋白的表達。2結果2.1pGEXKGGSTSOX4(130~344aa)原核表達載體的構建及鑒定將構建的pGEXKGGSTSOX4(130~344aa)原核表達載體用BamHI和HindIII雙酶切經瓊脂糖凝膠電泳分析可見酶切反應產物中出現(xiàn)大小約為640bp的片段表明目的片段已成功地插入表達

13、載體(圖1)。經核酸序列測定證實插入片段為SOX4編碼序列且序列完全正確。用該表達載體轉化大腸桿菌DH5α經IPTG誘導重組蛋白表達超聲裂解全菌后通過SDSPAGE鑒定在約49kD處可見預期分子量大小的條帶證實GSTSOX4(130~344aa)融合蛋白在轉化菌中表達成功而用IPTG誘導pGEXKGGST空載體轉化菌則未見此條帶(圖2)。進一步通過對轉化菌超聲后的上清及沉淀進行分析發(fā)現(xiàn)表達產物存在于轉化菌超聲上清中表明重組蛋白以可溶性形

14、式表達。2.2重組蛋白的純化在小量誘導表達的基礎上將pGEXKGGSTSOX4(130~344aa)表達載體轉化的DH5??接種于400mL培養(yǎng)基IPTG誘導后收集轉化菌超聲上清用谷胱甘肽Sepharose4B珠子純化GSTSOX4(130~344aa)融合蛋白SDSPAGE分析結果見圖3。通過洗脫、凍干后獲得了純化的GSTSOX4(130~344aa)重組蛋白。圖1質粒pGEXKGSOX4(130~344aa)的酶切鑒定Fig.1Id

15、entificationoftherecombinantvect.pGEXKGSOX4(130?344aa)byrestrictionenzymedigestion.1:befedigestion2:afterdigestionM:marker.圖2融合蛋白的小量誘導表達Fig.2Expressionofthefusionproteinatasmallscalebyinduction.1:befeinductionfpGEXKG2:af