1、大量研究表明,紅斑丹毒絲菌是豬丹毒的病原體,而64kDa的SpaA蛋白是該菌的主要保護(hù)性抗原,可作為研制豬丹毒亞單位疫苗的靶抗原。但是關(guān)于SpaA的免疫保護(hù)區(qū)域及其致病性尚未清楚。因此,本論文為確定SpaA免疫保護(hù)區(qū)域及其致病性開展了以下研究工作。
　　根據(jù)豬丹毒絲菌spaA基因序列設(shè)計(jì)3對(duì)引物,用PCR從強(qiáng)毒株C43065基因組中分別擴(kuò)增編碼SpaA及其N端免疫保護(hù)區(qū)和C端重復(fù)序列的基因片段,將它們分別連接到表達(dá)載體pET-32

2、a(+)的BamHⅠ和HindⅢ多克隆位點(diǎn)上,構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-spaA、pET-spaA-N和pET-spaA-C,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21,用菌液PCR初選重組菌,通過DNA測(cè)序驗(yàn)證閱讀框是否正確,IPTG誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白,用Ni+2親和層析柱純化N端帶有Trx標(biāo)簽的重組蛋白rSpaA、rSpaA-N和rSpaA-C,用清潔兔經(jīng)皮下注射抗原3次制備它們的抗體,通過小鼠免疫保護(hù)試驗(yàn)檢測(cè)rSpaA、rSpaA-N和rSpaA-C的保護(hù)作用

3、。SDS-PAGE和蛋白印跡結(jié)果表明,用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)BL21/pET32a(+)成功表達(dá)了重組蛋白rSpaA、rSpaA-N和rSpaA-C,小鼠保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果顯示rSpaA免疫組小鼠和rSpaA-N免疫組小鼠對(duì)強(qiáng)毒株C43065致死性攻擊的保護(hù)率均為100％,而rSpaA-C免疫組小鼠無(wú)免疫保護(hù)作用,表明SpaA的保護(hù)作用與其N端氨基酸序列有關(guān)。
　　為了從基因水平上驗(yàn)證SpaA的致病性,用DNA重組技術(shù)構(gòu)建中間為Tetr基因

4、,兩側(cè)為spaA基因上下游同源序列同源的敲除載體pUC18ΔspaA,將其電轉(zhuǎn)入野生株C43065,用四環(huán)素抗性和菌液PCR初選spaA基因的缺失突變株,并用組合PCR、逆轉(zhuǎn)錄PCR、DNA測(cè)序和蛋白印跡對(duì)突變株進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果表明spaA基因的缺失突變株C43065ΔspaA構(gòu)建成功。
　　通過細(xì)菌生長(zhǎng)曲線測(cè)定突變株C43065ΔspaA的生長(zhǎng)速率,采用補(bǔ)體試驗(yàn)、吞噬試驗(yàn)、粘附試驗(yàn)和小鼠毒力試驗(yàn)檢測(cè)突變株C43065ΔspaA的致

5、病性。顯微鏡觀察和細(xì)菌生長(zhǎng)曲線結(jié)果表明spaA基因的缺失突變影響了細(xì)菌的形態(tài)和生長(zhǎng)速率;補(bǔ)體敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示與野生株C43065和互補(bǔ)株C43065C相比突變株C43065ΔspaA對(duì)補(bǔ)體介導(dǎo)的殺菌作用的抵抗力顯著減低,吞噬試驗(yàn)結(jié)果表明小鼠巨噬細(xì)胞對(duì)突變株C43065ΔspaA的吞噬指數(shù)顯著高于野生株C43065和互補(bǔ)株C43065C;粘附實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示突變株C43065ΔspaA對(duì)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞和雞胚成纖維細(xì)胞的粘附能力顯著低于野