1、采用λ噬菌體Red重組系統(tǒng)構建鴨大腸桿菌標準菌株O73的acrB基因缺失突變株，采用熒光定量RT-PCR方法，測定并比較了O73及其不同約物誘導的5株耐藥菌、acrB基因缺失突變菌株及其不同藥物誘導的5株acrB基因缺失菌的主動外排基因和調控基因的mRNA的表達水平，探討多重耐約性產生和調控的分子機制。本試驗創(chuàng)新建立適合動物源細菌耐藥基因敲除、構建耐藥基因缺失株的分子生物學方法，為進一步開展多耐約基因同時缺失奠定方法學基礎。
　　

2、利用λ噬菌體Red重組系統(tǒng)對鴨大腸桿菌標準菌株O73的acrB基因進行敲除。首先，基于禽大腸桿菌acrB基因的已知序列，PCR擴增獲得兩端帶有FRT位點的卡那霉素抗性基因片段。然后，將pkD46質粒轉化入O73，再把含有卡那霉素抗性基因的打靶DNA片段電轉化入O73/pkD46。在Red重組系統(tǒng)表達重組酶的幫助下，卡那霉素抗性基因兩側的acrB基因同源序列與鴨大腸桿菌染色體上的acrB基因發(fā)生同源重組，用卡那霉素抗性平板篩選得到陽性克隆

3、。結果表明:用短同源臂和長同源臂的Red重組技術，均得到了acrB基因敲除菌株O73△acrB。長同源臂的電轉化效率高于長同源臂，但其打靶DNA片段的構建較為困難。
　　采用微量稀釋法測定AcrB基因敲除前、后及用5種不同約物（慶大霉素、頭孢噻呋、氟苯尼考、恩諾沙星、多西環(huán)素）誘導后相應O73菌株的耐藥表型。結果表明:敲除acrB基因后的O73菌株，其約物敏感性明顯較原標準菌株升高。慶大霉素、頭孢噻呋、氟苯尼考、恩諾沙星、多西環(huán)素

4、的MIC，敲除前分別為:2、8、16、2和8μg/mL;敲除后的分別為:1、0.06、2、0.03和0.5μg/mL。O73經5種約物分別誘導30代后，測得的MIC值均達到128μg/mL;而O73△acrB經5種藥物分別誘導30代后，測得的MIC值分別為:4、2、4、2和4μg/mL，且繼續(xù)誘導，其MIC值也不能再升高。這表明:acrB基因在主動外排中的有重要作用。
　　用熒光定量RT-PCR方法，測定了上述12株菌的5種主動外

5、排基因acrA、acrD、tolC、acrE、acrF基因和3種主動外排調控基因marA、soxS、robA基因的mRNA表達水平，反向研究acrB基因在鴨大腸桿菌多重耐藥中的作用。對于O73的5種誘導菌株，acrA和tolC的表達量均有上升，恩諾沙星誘導尤為明顯;acrF的表達量在各種約物誘導株中都有所下降;恩諾沙星誘導時，marA基因的表達量增加更為明顯;5種約物誘導的菌株，soxS基因的表達量均有所下降。慶大霉素誘導時，acrD和

6、acrE基因的mRNA表達量增加明顯;多西環(huán)素誘導時，robA基因mRNA表達量增加明顯。
　　對于O73△acrB，acrA的表達量顯著代償性增長，三種正向調控基因的表達量也顯著增加，marA的表達量增加尤為突出。這表明:在敲除acrB基因后，其主動外排調控基因相應的作用增強。O73△acrB其經過約物誘導后，3種外排調控基因的表達量都有所增加，而且增加幅度遠遠高于O73的藥物誘導菌株。氟苯尼考、恩諾沙星誘導的，acrD的表達量