1、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC)是導致新生仔豬腹瀉最常見的病原性大腸桿菌，能引起新生仔豬和斷奶仔豬腹瀉，發(fā)病率高，死亡率也高。耶爾森菌強毒力島（High-pathogeniticity island，HPI）最早是在高致病性耶爾森菌中發(fā)現(xiàn)，與鐵載體的合成、攝取、運輸有關，并且與耶爾森菌的毒力和致病性相關，對小鼠有強致死性。已有研究發(fā)現(xiàn)禽致病大腸桿菌(Avian pathoge

2、nic E coli，APEC)中也存在HPI，并且與細菌的毒力密切相關。本實驗室前期在對K88 ac+ETEC國內(nèi)參考株C83902的全基因組測序中識別到一個約29kb的毒力島，與耶爾森菌HPI高度同源。為了探究HPI在K88ac+ETEC的功能作用，本研究針對K88ac+ETEC C83902中強毒力島HPI設計了如下試驗。
　　1、利用CRISPR/Cas9基因編輯技術構建強毒力島HPI缺失株
　　根據(jù)本實驗室前期對C

3、83902進行全基因組測序的結果，設計針對強毒力島HPI缺失的引物，分別將能合成sgRNA的基因和HPI上下游同源臂融合到質(zhì)粒pTarget上，構建重組質(zhì)粒pTargetT，該質(zhì)粒能穩(wěn)定表達sgRNA并提供同源重組的修復模板。將重組質(zhì)粒和含有編碼Cas9基因以及λ-RED重組酶系統(tǒng)基因的pCas質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化入野生株C83902，進行強毒力島HPI的無痕敲除;通過PCR驗證，成功獲得了基因缺失株C83902△HPI。
　　2、強毒力島

4、HPI在K88ac+ETEC C83902中功能探析
　　在C83902△HPI構建成功的基礎上，比較分析了野生株和缺失株的相關生物學特征的變化。體外生長試驗表明，在相同的培養(yǎng)條件下，野生株C83902和缺失株C83902△HPI在生長周期的各個階段的生長速度基本一致。在養(yǎng)分充足的條件下，缺失株的鐵載體合成量與野生株基本一致，沒有明顯變化。生物被膜定量試驗表明缺失株的生物被膜形成能力明顯低于野生株，下調(diào)了50.97％(P＜0.05

5、)。細菌與仔豬空腸上皮細胞IPEC-J2的粘附試驗結果顯示，缺失株對IPEC-J2細胞的粘附能力較野生株下降23.3％。研究進一步通過Real-Time PCR試驗檢測強毒力島HPI缺失株中重要毒力因子K88菌毛、sfm菌毛、絲氨酸蛋白酶、Ⅰ型菌毛、共生菌毛、莢膜、α菌毛、鼠傷寒沙門菌菌毛、長極性菌毛、鞭毛、溶血素和彎曲菌毛等的主要亞單位編碼基因的轉(zhuǎn)錄量變化，結果發(fā)現(xiàn)，與野生株相比，faeG的表達量下降了12.02％，sfmH的表達量下

6、降了15.58％，sepA的表達量下降了37％(P＜0.01)，fimH的表達量下降了11.78％，ecpA表達量下降了30.4％(P＜0.05)，kpsD的表達量下降了37.5％(P＜0.05)，clbD的表達量下降了37.75％(P＜0.05)，stfG的表達量下降了34.84％(P＜0.01)，ipfA的表達量下降了35.3％(P＜0.01)，fliC的表達量下降了41.2％(P＜0.01)，而hlyA和csgB的表達量幾乎沒有變