1、產腸毒素大腸桿菌(Enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC)系一類致人和幼畜（初生羔羊、犢牛、羔羊及斷奶仔豬）腹瀉最常見的病原性大腸桿菌，其毒力因子主要包括黏附素菌毛、腸毒素、產志賀氏菌毒素、溶血素等。α-溶血素在ETEC的致病機理中很少受到關注，是一種RTX(repeats in toxin)毒素蛋白，對于大部分哺乳動物細胞（如紅細胞、粒細胞、單核細胞和內皮細胞）都具有溶細胞活性和細胞毒性，能夠整合

2、進宿主細胞膜，影響細胞膜的穩(wěn)定性，使其內容物滲漏或者裂解，是大腸桿菌腸外感染的一個重要的毒力因子?；贙88ac+/ K88ad+ETEC都具有溶血素基因，且兩者病原致病機理不盡相同。我們成功構建hlyA毒素基因缺失株，為進一步深入研究hlyA毒素與機體相互作用的分子機制，溶血素的致病機理及對豬大腸桿菌病的防控策略奠定一定基礎。
　　1、利用Red同源重組技術構建hlyA基因缺失株
　　根據GenBank中已報道的ETEC

3、hlyA基因的序列，首先合成一對引物（引物5'端與hlyA基因同源，而3'端與pKD3質粒上氯霉素抗性基因cat同源），經PCR擴增后得到具有氯霉素抗性基因和hly基因同源臂的產物，將PCR擴增產物直接轉化入大腸桿菌中，在pKD46表達的重組酶作用下，PCR產物兩端的hlyA基因同源序列與大腸桿菌染色體上的的同源序列發(fā)生同源重組交換，利用抗性篩選得到陽性一次重組菌。利用編碼Flp重組酶的質粒pCP20，去除氯霉素抗性基因，最后在染色體上

4、只留下一個FRT位點，得到二次重組菌，通過PCR擴增及測序鑒定缺失株的正確構建。本試驗成功構建了大腸桿菌標準株K88ac、K88ad的hlyA基因缺失株。同時我們將表達hlyA基因的pBR322質粒導入缺失株，構建了互補株。
　　2、溶血素在大腸桿菌致病過程中作用初探
　　在K88ac△hlyA、K88ad△hlyA成功構建的基礎上，比較分析了野生株和缺失株相關生物學特性的變化。體外生長實驗和酵解實驗表明，同樣的培養(yǎng)條件下，

5、缺失株K88ac△hlyA、K88ad△hlyA株生長速度及生長周期各個階段的特性與野生株相比基本沒有差異，其分解發(fā)酵糖類和氨基酸的能力也未發(fā)生改變。同時將6周齡ICR小鼠分為1個對照組和6個攻毒組，經灌胃途徑分別對各攻毒組小鼠接種109cfu劑量的大腸桿菌懸液，定期觀察接種后小鼠的狀態(tài)（飲食、飲水、精神狀態(tài)和死亡情況），對死亡小鼠進行剖檢記錄病理變化，結果顯示:經野生株和回補株攻毒的小鼠有出血死亡的現象，而缺失株沒有，說明hlyA會影