1、腸毒素大腸桿菌(ETEC)是引起新生仔豬和斷奶仔豬腹瀉的主要致病性大腸桿菌。本研究建立了豬源腸毒素大腸桿菌常見的菌毛基因型K88、K99、987P、F41和F18及其亞型的PCR分型檢測方法,調(diào)查了湖北省內(nèi)規(guī)?；i場進行了ETEC菌毛基因型的分布特征,確定了K88和F18是引起斷奶仔豬腹瀉的ETEC兩種最常見菌毛蛋白基因型。利用基因工程技術構建了表達K88ac菌毛亞單位基因faeG和F18ac菌毛亞單位基因fedF的融合基因faeG-l

2、inker-fedF的重組質(zhì)粒,實現(xiàn)了faeG和融合基因faeG-linker-fedF在大腸桿菌中的表達,并探討了重組的菌毛蛋白的免疫原性及其誘導產(chǎn)生卵黃抗體的作用,通過體外試驗和動物試驗評價由重組菌毛蛋白免疫制備的卵黃抗體在預防和控制斷奶仔豬腹瀉的潛在應用價值,進一步研究了卵黃抗體在斷奶仔豬日糧中應用。結果如下:
　　 1.以ETEC標準菌株為試驗材料,建立了ETECK88、K99、987P、F41、F18及其變異體的PCR

3、鑒定方法,并對湖北省部分地區(qū)規(guī)?；f頭豬場進行了ETEC流行病學調(diào)查。結果表明:通過設計特異性引物,經(jīng)PCR擴增出對應的目的片段。對2002-2003年來源于新生仔豬和斷奶仔豬的227份腹瀉糞樣進行了K88及其變異體和K99的PCR檢測,結果顯示,23份(10.1％)被確定為含有ETECK88,其變異體均為K88ac；13份含有K99(5.7％)。對2004年179份來源于1d至6w仔豬的腹瀉糞樣進行了ETECK88、K99、987P、

4、F41、F18及其變異體的PCR檢測,共有60份(33.52％)含有ETEC菌毛基因型的一種或幾種。其中,36份含有K88菌,占60.00％,是最主要的一種菌毛基因型；K88進一步的分型鑒定結果則顯示,4份檢出為K88ac(11.11％),32份為K88ad(88.89％),未檢測出K88ab。含F(xiàn)18的樣品數(shù)有16份,占26.67％:進一步的分型結果顯示F18ab5份(8.33％),F18ac11份(18.34％)。另外,含K99菌的

5、有2份(3.33％),987P有11份(18.33％),F41有3份(5.00％)。本試驗結果表明,PCR方法鑒定ETEC具有快速、特異性強、敏感性和準確性高的優(yōu)點,適合于大規(guī)模的流行病學調(diào)查；K88和F18是湖北地區(qū)新生仔豬和斷奶腹瀉糞樣中最常見的兩類菌毛基因型。
　　 2.通過PCR擴增技術,用疏水性連接肽(Gly4Ser)3序列連接faeG和fedF兩基因片段,構成融合基因faeG-linker-fedF,并分別構建fae

6、G和faeG-linker-fedF的重組表達質(zhì)粒。測序結果表明重組質(zhì)粒中目的片段的DNA序列正確,將該重組表達質(zhì)粒導入E.ColiDH5a和BL21(DE3)中誘導表達,結果faeG和faeG-linker-fedF在大腸桿菌中均獲得高效表達,它在BL21(DE3)中的表達量均占總蛋白含量的30％左右,表達產(chǎn)物以包涵體的形式存在。
　　 3.采用響應面分析方法,對腸毒素大腸桿菌K88黏附素亞單位重組蛋白FaeG誘導表達的主要影

7、響因素進行了優(yōu)化研究。響應面分析結果表明:不同的誘導時機、IPTG濃度及誘導時間對目的蛋白表達量均有顯著影響(P＜0.01),而三因素之間的交互作用對目的蛋白表達量也有極顯著的影響(P＜0.01)。通過進一步的模擬優(yōu)化,得到了最佳誘導表達條件為:培養(yǎng)BL21(K88ac)重組菌株2.5h后,加入IPTG至終濃度0.8mmol/L,37℃誘導培養(yǎng)5h。采用以上參數(shù)進行驗證實驗,得到目的蛋白在全菌蛋白中的表達含量為35.4％；與單次單因子法

8、得到的最佳表達條件下的表達量(27.5％)相比,提高了28.7個百分點。本試驗結果表明,采用響應面分析法可以確定IPTG的誘導時機、誘導濃度及誘導時間等多個因素對重組蛋白在大腸桿菌中表達的最佳作用條件,有利于提高目的蛋白的表達量。
　　 4.應用免疫印跡技術檢測重組蛋白rFaeG和FaeG-FedF的免疫原性,結果發(fā)現(xiàn)rFaeG和FaeG-FedF均能夠與兔抗K88ac陽性血清抗體發(fā)生特異性抗原抗體結合反應,FaeG-FedF還

9、能夠與F18“a”因子血清發(fā)生特異性抗原抗體反應,這表明重組蛋白rFaeG和融合蛋白FaeG-FedF具有與天然菌毛蛋白相同或相似的抗原性。將重組蛋白rFaeG和融合蛋白FaeG-FedF免疫蛋雞,結果發(fā)現(xiàn)兩種重組蛋白均能刺激蛋雞產(chǎn)生免疫應答反應,并誘導卵黃抗體產(chǎn)生,在二免1周卵黃中的抗體水平便明顯升高,平均效價可達1:210以上,且此抗體水平可以維持較長一段時間。因此,重組蛋白rFaeG和融合蛋白FaeG-FedF可以作為卵黃抗體生產(chǎn)

10、的候選免疫原。
　　 5.用分離提純的K88ac菌毛蛋白、重組蛋白rFaeG和融合蛋白FaeG-FedF免疫28周齡左右海蘭褐開產(chǎn)蛋雞,并收集雞蛋將其噴霧干燥成粉,分別為Anti-K88acSDEP,Anti-rFaeGSDEP和Anti-FaeG-FedFSDEP。利用體外試驗研究了重組蛋白rFaeG和FaeG-FedF免疫獲得的卵黃抗體抑制細菌黏附作用,結果顯示:無抗體的對照組平均每個上皮細胞黏附7.6個K88ac；由提純蛋

11、白免疫獲得的Anti-K88acSDEP以及Anti-rFaeGSDEP和Anti-FaeG-FedFSDEP較對照組均極顯著抑制了K88ac對腸上皮細胞的黏附作用,平均每個上皮細胞分別僅黏附1.0、1.2和1.0個細菌(P＜0.01)。3種卵黃抗體粉對細菌黏附腸上皮細胞均具有顯著抑制作用,且三者的作用效果無明顯差異(P＞0.05)。此外,與F18ac對照組相比,經(jīng)Anti-FaeG-FedFSDEP處理后的F18ac黏附于腸上皮細胞上

12、的數(shù)量極顯著減少(P＜0.01)；同樣經(jīng)Anti-FaeG-FedFSDEP處理后的F18ab對腸上皮細胞的黏附也明顯低于F18ab對照組(P＜0.01)。由此表明,由重組菌毛蛋白rFaeG和Fae-FedF制備的卵黃抗體均可以有效抑制K88ac對仔豬腸上皮細胞的黏附；此外,具備兩種菌毛基因型的融合蛋白FaeG-FedF免疫獲得的卵黃抗體,不僅可以抑制同源菌株F18ac的黏附作用,還可以阻斷異源菌株F18ab對腸上皮細胞的黏附。