1、目的:產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens,C.perfringens)是一種廣泛分布于水源、土壤等自然界以及動物腸道中的重要病原體,常導致人和家畜多種重要疾病,如:人氣性壞疽、食物中毒,牛羊猝死癥、羊腸毒血癥、羔羊腹瀉、禽壞死性腸炎等。由該菌引起的感染發(fā)病急、病程短、死亡率高,常給畜禽養(yǎng)殖業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失。因此,了解和掌握新疆羊源性產(chǎn)氣莢膜梭菌主要流行毒素型和菌株耐藥狀況,開展毒力基因的原核表達和免疫原性研

2、究將為該菌感染的防治提供參考資料。
　　方法:本文對2010-2012年新疆部分羊場送檢病料進行涂片鏡檢、培養(yǎng)特性觀察、生化試驗初步分離鑒定出產(chǎn)氣莢膜梭菌。用PCR擴增16S rRNA序列,并進行序列測定和同源性比對,對確定為產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株進行毒素分型,分析新疆地區(qū)主要流行毒素型。根據(jù)我國衛(wèi)生部發(fā)布的厭氧菌抗微生物藥物敏感試驗方法(厭氧菌的抗微生物藥敏實驗標準,2005)選取青霉素,鹽酸克林霉素,甲硝唑,頭孢曲松,替卡西林等藥物

3、對產(chǎn)氣莢膜梭菌臨床分離株進行藥物敏感性檢測,了解菌株耐藥狀況。
　　參考GenBank(登錄號X17300.1)已發(fā)表的產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素的全基因序列,設(shè)計針對α毒素成熟肽序列的引物,采用PCR方法擴增α毒素成熟肽序列,將其插入質(zhì)粒pET-28b構(gòu)建重組表達載體pET-28b-cpa。重組載體pET-28b-cpa經(jīng)PCR、雙酶切和測序鑒定后轉(zhuǎn)化BL21(DE3)plys S感受態(tài)細胞,用IPTG對重組菌進行誘導表達。表達產(chǎn)物用S

4、DS-PAGE和Western blot檢測,確定其表達形式和反應原性,并對重組菌的表達條件進行優(yōu)化確定最佳誘導條件。采用Ni-NTA對α毒素進行批量純化,使用Bradford蛋白濃度測定試劑盒測定純化蛋白濃度,將純化蛋白與弗氏佐劑等體積混合制備亞單位疫苗免疫小鼠,通過抗體檢測和攻毒試驗評價其免疫效果。
　　結(jié)果:通過病料染色鏡檢、細菌分離、培養(yǎng)特性觀察、生化鑒定和16S rRNA檢測結(jié)果表明,從臨床送檢病料中共分離49株產(chǎn)氣莢膜

5、梭菌。毒素分型結(jié)果顯示,毒素A型菌株占61.2％(30/49),毒素B型菌株占2.04%(1/49),毒素D型菌株占36.7%(18/49),表明當前新疆地區(qū)羊源產(chǎn)氣莢膜梭菌主要流行株為毒素A型和D型。
　　對實驗分離得到的菌株進行藥敏實驗,結(jié)果顯示,對甲硝唑、克林霉素、青霉素、頭孢曲松、替卡西林耐藥菌株分別為79.6%、49.0%、38.8%、12.2%和10.2%。從結(jié)果可以看出,我國羊源產(chǎn)氣莢膜梭菌耐藥情況比較嚴重。

6、　　本實驗成功擴增出了α毒素成熟肽序列,其分子量大小為1110bp;構(gòu)建重組表達載體pET-28b-cpa并轉(zhuǎn)化受體菌,通過目的基因誘導表達,檢測結(jié)果表明,重組α毒素蛋白分子量為42.1kDa,與預期大小相符,且具有反應原性;對表達條件進一步優(yōu)化發(fā)現(xiàn),目的基因在25℃,IPTG濃度1.0mmol/L,誘導4h的條件下獲得最佳表達,目的蛋白占菌體可溶蛋白的34.6%,且以可溶性表達為主。用重組蛋白制備亞單位疫苗免疫小鼠,結(jié)果表明,重組α毒