1、漁用疫苗接種因其可有效地預防水產動物疾病，又能避免抗生素等藥物對水環(huán)境和水產品本身造成的污染，已成為國際上水產疫病防控的主流技術。免疫佐劑是指結構多樣具有調節(jié)疫苗抗原固有免疫原性屬性的物質。細胞因子是機體的自身成分，作為佐劑，相比傳統(tǒng)佐劑具有更多優(yōu)勢。IL-8是由多種細胞產生具有趨化屬性的細胞因子，它能促進局部的炎癥反應，趨化T細胞和調節(jié)其細胞因子的產生。研究表明，IL-8作為細胞因子佐劑對疫苗具有免疫增強作用，可顯著增強疫苗的免疫保護

2、效力。本文以斑點叉尾鮰源IL-8作為細胞因子佐劑來驗證其能否增強斑點叉尾鮰源海豚鏈球菌疫苗的免疫效力。具體內容包括:
　　1.斑點叉尾鮰IL-8基因的克隆及分子特性分析
　　采用RT-PCR法從斑點叉尾鮰脾臟中擴增出IL-8(CcIL-8)基因，并將CcIL-8片段克隆到pMD19-T載體中，構建重組質粒。應用生物信息學工具對該基因的核苷酸序列及其推導的氨基酸序列進行分子特性分析。結果表明:CcIL-8全長336 bp，包含

3、一個完整的開放閱讀框，編碼111個氨基酸，含有CXC型趨化因子保守結構域和信號肽;存在跨膜區(qū);含有2個潛在的絲氨酸磷酸化位點和2個潛在的N-糖基化位點;二級結構主要由α-螺旋和β-折疊組成;氨基酸序列分析表明本研究得到的是斑點叉尾鮰IL-8短的可變轉錄本，該氨基酸與印度囊鰓鯰（Heteropneustes fossils）IL-8氨基酸的一致性高達87.1％，進化樹上聚為一簇，親緣關系較近，與鯉魚、斑馬魚和虹鱒等硬骨魚類親緣關系較遠。<

4、br>　　2.斑點叉尾鮰IL-8成熟肽基因的原核表達及其作為海豚鏈球菌亞單位疫苗免疫佐劑的效果評價
　　參照已克隆的CcIL-8序列設計去信號肽引物，克隆到斑點叉尾鮰成熟肽（mCcIL-8）基因，全長264 bp。將成熟肽基因與pET-32a(+)載體連接，構建原核表達載體pET-32a(+)-mCcIL-8，并于表達菌BL21(DE3)中誘導表達，成功表達大小約為29 kDa的重組斑點叉尾鮰IL-8成熟（重組mCcIL-8）蛋白

5、。經過Ni-NTA親和層析純化以及梯度透析復性后，Western-blot和SDS-PAGE檢測分別表明重組蛋白融合表達成功以及該蛋白已純化為單一條帶。為驗證純化復性的重組mCcIL-8(rmCcIL-8)蛋白是否具有免疫佐劑效應，將重組mCcIL-8蛋白(20μg/尾)與海豚鏈球菌亞單位疫苗S.iniae-rENO（50μg/尾）混合腹腔注射免疫斑點叉尾鮰（80±10 g），同時以重組mCcIL-8蛋白為蛋白佐劑對照組、S.iniae

6、-rENO為疫苗對照組和PBS為陰性對照組。(1)血清非特異性免疫指標:于免疫后的第1、3、7、14、21、28和56 d采血液，收集血清，對斑點叉尾鮰血清中溶菌酶活力和ACH50活性這兩個非特異性免疫指標進行測定。結果:與S.iniae-rENO組相比，S.iniae-rENO+rmCcIL-8組溶菌酶活力于免疫后第1、3和7d得到極顯著(P＜0.01)增強，第14d時兩疫苗組無顯著差異，但均極顯著(P＜0.01)高于蛋白佐劑對照組和

7、陰性對照組，第21d后的各個時間點各組溶菌酶活力無顯著差異;ACH50活性于免疫后第1和3d得到顯著(P＜0.05)增強，第7和14d時兩疫苗組無顯著差異，但均極顯著(P＜0.01)高于蛋白佐劑對照組和陰性對照組，第21d后的各個時間點各組ACH50活性無顯著差異。表明:重組mCcIL-8蛋白能夠在一定時間內增強亞單位疫苗S.iniae-rENO誘導的溶菌酶和ACH50水平。(2)血清ELISA抗體:于免疫后第7、14、21、28、35

8、、42和56 d采血液，收集血清，采用間接ELISA法檢測斑點叉尾鮰血清中抗rENO抗體水平。結果:在免疫后第14 d檢測到疫苗組出現(xiàn)特異性抗體;S.iniae-rENO+rmCcIL-8組在第14d到42 d的抗體水平顯著(P＜0.05)高于S.iniae-rENO組，并于第28 d達到峰值，第35 d抗體水平下降;第56 d疫苗組均未能檢測到特異性抗體。表明:重組mCcIL-8蛋白能提高亞單位疫苗S.iniae-rENO的抗體水平，

9、但是未能延長抗體產生的持續(xù)時間。(3)免疫相關基因的表達:于免疫后第28 d進行攻毒試驗的24 h后收集疫苗組和陰性對照組的頭腎組織，采用qRT-PCR檢測各組試驗魚免疫相關基因的相對表達量。結果:S.iniae-rENO+rmCcIL-8組試驗魚的IL-1β、TNF-α、CXCL10和MHCⅡβ等基因的相對表達量顯著(P＜0.05)高于S.iniae-rENO組。表明:重組mCcIL-8蛋白促使亞單位疫苗S.iniae-rENO產生更

10、強的免疫反應和MHCⅡ類抗原提呈反應。(4)攻毒保護率:于免疫后第28和56 d分別進行攻毒試驗，對兩次攻毒后各組的死亡率及疫苗組的保護率進行統(tǒng)計。結果:第一次攻毒后，S.iniae-rENO+rmCcIL-8組的相對免疫保護率(71.42％)明顯高于S.iniae-rENO組(49.99％)，但是第二次攻毒后，兩種疫苗均無較好的免疫保護力。表明:亞單位疫苗S.iniae-rENO+rmCcIL-8能誘導魚體產生更強的保護免疫力，重組m

11、CcIL-8蛋白能增強亞單位疫苗S.iniae-rENO的免疫保護效力，但未能延長該疫苗的保護時間。
　　3.斑點叉尾鮰IL-8基因真核表達載體的構建及其作為海豚鏈球菌DNA疫苗免疫佐劑的效果評價
　　將含Kozak和6×CAC標簽序列的CcIL-8(MCcIL-8)基因克隆至pcDNA3.1(+)真核表達載體中，成功構建真核重組表達質粒pcDNA3.1(+)-MCcIL-8(pc-MCcIL-8)，從RNA水平上，通過RT

12、-PCR法檢測到肌肉注射pc-MCcIL-8的第7、14、28和56 d后均有MCcIL-8基因的轉錄;從蛋白質水平上，通過免疫組織化學檢測到MCcIL-8蛋白在斑點叉尾鮰肌肉組織中的表達。為驗證pc-MCcIL-8質粒DNA是否具有免疫佐劑效應，將pc-MCcIL-8(25μg/尾)與海豚鏈球菌DNA疫苗pcDNA3.1(+)S.iniae-eno(pc-Sieno，25μg/尾)混合肌肉注射免疫斑點叉尾鮰(80±10g)，同時設基因

13、佐劑對照組pc-MCcIL-8、DNA疫苗對照組pc-Sieno和空載體對照組pcDNA3.1(+)(pc)。(1)血清非特異性免疫指標:于免疫后第1、3、7、14、21、28和56 d采血液，收集血清，對斑點叉尾鮰血清中溶菌酶活力和ACH50活性這兩個非特異性免疫指標進行檢測。結果:pc-Sieno+pc-MCcIL-8組溶菌酶活力于免疫后第3～56 d均顯著(P＜0.05)高于pc-Sieno組，并于第21 d達到峰值;ACH50活

14、性于免疫后第3～56 d均極顯著(P＜0.01)高于pc-Sieno組，并于第14d達到峰值。表明:pc-MCcIL-8能增強DNA疫苗pc-Sieno刺激魚體產生溶菌酶和ACH50的水平;(2)血清ELISA抗體:于免疫后第7、14、21、28、35、42和56 d采血液，收集血清，采用間接ELISA法檢測斑點叉尾鮰血清中抗ENO抗體水平。結果:在免疫后第14～56 d各個時間點，pc-Sieno+pc-MCcIL-8組抗體水平極顯著

15、(P＜0.01)高于pc-Sieno組，并于第35 d達到峰值。表明:pc-MCcIL-8能明顯提高DNA疫苗pc-Sieno刺激斑點叉尾鮰產生的抗體水平。(3)免疫相關基因的表達:于免疫后第28 d進行攻毒試驗的24 h后收集疫苗組和空載體對照組的頭腎組織，qRT-PCR檢測各組試驗魚免疫相關基因的相對表達量。結果:pc-MCcIL-8能促進DNA疫苗極顯著(P＜0.01)上調IL-1β和CXCL10以及顯著(P＜0.05)上調TNF

16、-α和MHCⅡβ的相對表達量。表明:pc-MCcIL-8可能通過誘導IL-1β和TNF-α等細胞因子的分泌促進免疫反應以及增強MHCⅡ類抗原提呈反應而發(fā)揮佐劑效應;(4)攻毒保護率:于免疫后第28和56 d分別進行攻毒試驗，對兩次攻毒后各組的死亡率及疫苗組的保護率進行統(tǒng)計。結果:pc-Sieno+pc-MCcIL-8組（80％和73.33％）兩次攻毒的相對免疫保護率均明顯高于pc-Sieno組（60％和53.33％）。表明:pc-Sie