1、草魚是我國重要的淡水經(jīng)濟養(yǎng)殖魚類，但是隨著養(yǎng)殖密度的增加和養(yǎng)殖環(huán)境的惡化，草魚養(yǎng)殖中病害頻發(fā)，嚴重制約了其發(fā)展。其中草魚出血病是一種危害較大的病毒性傳染病，草魚呼腸孤病毒(Grass Carp Reovirus，GCRV)則是引起該病的主要病原。多年來，科研人員已對GCRV的形態(tài)特征、病毒基因組及蛋白晶體結構、病毒蛋白功能、細胞敏感性等進行了分析與鑒定，然而對病毒感染過程中草魚的免疫應答機制，以及宿主與病毒間相互作用的研究還相對比較薄弱

2、。本論文以我國主要淡水養(yǎng)殖魚類之一草魚(ctenopharyngodon idellus)為研究對象，應用同源性克隆和RACE-PCR技術克隆得到了草魚NEDD4結合蛋白基因1(NEDD4 binding protein1, N4BP1)，并命名為Ci N4BP1。該基因cDNA序列全長為1131 bp，5′非編碼區(qū)（5′-UTR）為98 bp，3′非編碼區(qū)（3′-UTR）為481 bp，開放閱讀框（open reading frame

3、，ORF）為552 bp，編碼183個氨基酸。預測分子量（MW）為19.8kDa，理論等電點（pI）為9.13。氨基酸序列分析結果表明CiN4BP1所編碼的氨基酸序列與稻田魚(Oryzias latipes)相應基因編碼的氨基酸序列最高同源性為76％，進化樹表明與斑馬魚(Danio rerio)相應蛋白的親緣關系較近。在健康草魚體內，CiN4BP1頭腎、胸腺、鰓、脾臟中表達量較高，而經(jīng)草魚呼腸孤病毒感染后，Ci N4BP1在頭腎、胸腺、

4、腦、脾臟、體腎、胃、肌肉和肝臟等組織中的表達量均有上調。進一步的熒光定量 PCR結果表明，GCRV感染后草魚主要免疫器官（頭腎、體腎、脾臟、肝臟）以及CIK細胞中Ci N4BP1的表達量均隨著感染時間的延長逐漸升高。隨后，我們構建了原核表達重組質粒pET-N4BP1，導入大腸桿菌 BL21進行誘導表達，并優(yōu)化了最佳表達的溫度、IPTG濃度及誘導時間，最終確定pET-N4BP1重組蛋白的最佳誘導表達條件為：37℃，0.06 mmol·L-

5、1 IPTG，誘導4 h。為了研究Ci N4BP1的亞細胞定位及其在GCRV感染中的作用，我們構建了N4BP基因的真核表達載體pDsRed2-N4BP1，瞬時轉染CIK細胞后用熒光顯微鏡進行觀察，結果顯示CiN4BP1在主要分布在細胞質中。在此基礎上，我們用GCRV感染pDsRed2-N4BP1瞬時轉染的CIK細胞，并在不同時間點收樣檢測GCRV主要結構蛋白的表達情況。結果發(fā)現(xiàn)，CiN4BP1過表達能夠抑制GCRV主要結構基因VP6的轉