1、miR164是植物中一個較為保守的miRNA家族，在擬南芥中有三個拷貝，能夠通過調(diào)節(jié)靶基因.NAC轉(zhuǎn)錄因子家族基因表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控胚胎細(xì)胞、營養(yǎng)器官和花器官的發(fā)育。研究發(fā)現(xiàn)miR164在番茄果實中大量表達(dá)，推測miR164可能對番茄果實發(fā)育具有重要的調(diào)控作用。迄今為止沒有發(fā)現(xiàn)關(guān)于番茄miR164與果實發(fā)育相關(guān)的研究報道，因此克隆番茄miR164的前體且研究其與果實發(fā)育成熟的關(guān)系顯的尤為重要。
　　 為了研究miR164在番茄果實發(fā)

2、育及成熟過程中的功能，本研究克隆了番茄miR.164的前體及其靶基因.NAM構(gòu)建超表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化番茄。獲得主要研究結(jié)果如下：
　　 (1)miR164的前體序列(pre-miR164)的分離與鑒定：根據(jù)miR164所在基因組的序列設(shè)計引物，克隆miR164的前體序列(pre-miR164)約500bp，生物信息學(xué)分析表明此序列可形成穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。
　　 (2)miR164的表達(dá)模式分析：定量PCR分析miR164(pr

3、e-miR164)在番茄根、莖、葉、花和果實中的表達(dá)模式，結(jié)果表明miR164在各個組織中均有表達(dá)，其中在莖和果實中表達(dá)量最高。
　　 (3)miR164靶基因NAM的克隆及剪切位點突變：在番茄EST數(shù)據(jù)庫中尋找靶基因NAM，設(shè)計引物，克隆得到1，315bp的片段，5’RACE結(jié)果顯示miR164在第10個堿基處對NAM mRNA進(jìn)行特異性剪切，從而確定NAM是miR164的靶基因；利用大引物突變法，對剪切位點的4個堿基進(jìn)行了突

4、變。
　　 (4)靶基因NAM表達(dá)模式分析：定量PCR分析NAM在番茄根、莖、葉、花和果實中的表達(dá)模式，結(jié)果表明NAM在各個組織中均有較強表達(dá)，其中在莖中表達(dá)量最高。
　　 (5)轉(zhuǎn)基因植株表型分析：miR164超表達(dá)植株，在果實發(fā)育過程中花瓣不能正常脫落，且形成無籽果實。miR164共抑制和NAM超表達(dá)植株，萼片肥厚、融合，不能形成正常的花器官，果實無籽。NAM-M超表達(dá)植株，植株矮小、萼片肥厚、不能正常開花，果實無籽

5、。
　　 (6)控制花器官形成關(guān)鍵基因表達(dá)情況分析：miR164超表達(dá)植株中，MADS-box家族關(guān)鍵基因AP1，AP3，TPI，TAG，TM6表達(dá)量均降低，而在NAM超表達(dá)植株中表達(dá)增強。
　　 (7)NAC轉(zhuǎn)錄因子下游基因的表達(dá)分析：miR164超表達(dá)植株中，KNOX、PTS、CUC2-LIKE、DBP和PDBF基因表達(dá)水平降低，而在NAM超表達(dá)植株中表達(dá)量增強。
　　 綜上所述，miR164通過影響番茄花的