1、雞傳染性支氣管炎(Avian Infectious Bronchitis，IB)是由雞傳染性支氣管炎病毒(AvianInfectious Bronchitis Virus，IBV)引起的一種急性、高度接觸傳染性疾病，其臨床特征為病雞咳嗽、噴嚏、氣管啰音；幼雞流鼻液：蛋雞產(chǎn)蛋數(shù)量和品質(zhì)下降，是嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)的主要傳染病之一。疫苗免疫是當(dāng)前預(yù)防和控制雞傳染性支氣管炎的主要措施，針對不同致病型或血清型的病毒，國內(nèi)外均有多種疫苗毒株和疫苗效力評

2、價(jià)用強(qiáng)毒株。一些毒株用傳統(tǒng)的種毒鑒定方法很難準(zhǔn)確鑒別，尤其是血清型相同的毒株，因此有必要建立分子生物學(xué)鑒別方法，進(jìn)一步完善IBV特異性檢驗(yàn)方法，從而對IBV種毒進(jìn)行鑒定，并對國內(nèi)外疫苗進(jìn)行純凈性檢測。
　　 本研究以中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所菌種中心保存的不同年代的32株H120株、H52株和M41株種毒為研究對象，采用自行設(shè)計(jì)的特異性引物經(jīng)RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增得到病毒的S1蛋白基因片段。經(jīng)過序列分析，種毒H52中，1993年3月25日

3、與1993年3月28日凍干的H52種毒的S1基因序列與其他代次不同，但與M41株一致。查閱種毒原始記錄，該批次種毒檢定不合格，安全檢驗(yàn)表明接種該批次H52病毒的雞出現(xiàn)了呼吸噦音、甩頭等癥狀。1983年10月7日和1992年12月凍干的種毒與其他幾株相比，分別存在2個和9個核苷酸突變。H120種毒中未發(fā)現(xiàn)明顯堿基變異。M41株可分成兩組：79年、88年、91年、96年、93年4月、01年凍干的種毒序列一致；而76年、93年3月、06年凍干

4、的種毒序列一致，與H120相似。
　　 將從GenBank上下載的H52株、H120株、M41株以及歐洲使用的疫苗4/91株的全基因序列(全長27.6kb)進(jìn)行比對分析，從中找出他們之間序列差異較明顯的區(qū)域，使用自行設(shè)計(jì)的四對引物(引物對A、引物對B、引物對C、引物對D)對這四種毒株進(jìn)行擴(kuò)增。用引物對A時，能擴(kuò)增出M41株全基因組序列中2900～4690bp處長度為1791bp的目的片斷，所需的M41株最低病毒滴度為103.5E

5、ID50/mL，而無法擴(kuò)增出H52株和H120株，因此用該對特異性引物能夠區(qū)分M41株與H52株、H120株。用引物對B時，能夠擴(kuò)增出H52株和H120株全基因組序列中21588bp～23288bp處長度為1700bp的目的片斷，所需的H120(H52)株最低病毒滴度為103.5EID50/mL，再利用限制性內(nèi)切酶Nae I對PCR純化產(chǎn)物進(jìn)行酶切，H120株能夠被切成1000bp和700bp兩個片斷，而H52株的擴(kuò)增產(chǎn)物由于不存在該酶

6、切位點(diǎn)，所以無法切開。因此利用特異性引物對B并結(jié)合酶切的方法可以區(qū)分H52株和H120株。使用引物對C時，能夠擴(kuò)增出4/91毒株S1基因序列中長度為1351bp的目的片斷，所需的4/91株最低病毒滴度為102.5EID50/mL，并結(jié)合使用引物對D進(jìn)行套式PCR就能擴(kuò)增出4/91株S1基因中1066bp的目的片斷，而無法擴(kuò)增H52株、H120株和M41株，因此使用引物對C和引物對D能夠有效區(qū)分4/91疫苗株和H52株、H120株、M41

7、株，三對引物A、B、c均具有很好的特異性。
　　 從全國疫苗企業(yè)中隨機(jī)抽取了19個疫苗企業(yè)共75批IBV活疫苗、從市場上抽取了11個企業(yè)的共16批IBV活疫苗、從5個外國企業(yè)(中國代理)中共抽取了15批IBV活疫苗，對其進(jìn)行S1基因測序并使用上述建立的分子生物學(xué)鑒別方法進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示：H120株疫苗和H52株疫苗用引物對B進(jìn)行檢測時，結(jié)果符合率為100％，用引物對C和引物對D檢測發(fā)現(xiàn)，國內(nèi)禽苗企業(yè)的75批疫苗中有6個企業(yè)9批

8、疫苗、市場上抽取的16批禽疫苗中有1批疫苗出現(xiàn)了4/91株特異性片段，而從外企抽取的活疫苗均未出現(xiàn)4/91株特異性片段。綜上所述，本研究通過對中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所菌種中心保存的IBV種毒株的主要免疫原性基因S1基因進(jìn)行測序分析，并對IBV的H52株、H120株、M41株及國外流行疫苗毒株4/91株的全基因組進(jìn)行分析，建立的雞傳染性支氣管炎病毒種毒的分子生物學(xué)鑒別方法，進(jìn)一步完善了種毒特異性檢驗(yàn)方法。并將該方法應(yīng)用于國內(nèi)外市場中的雞傳染性支