1、玉米(Zea Mays L.)是全球重要的糧食、飼料和工業(yè)原料作物之一,在農(nóng)業(yè)經(jīng)濟發(fā)展及人類糧食安全中占有舉足輕重的地位。然而,干旱嚴重影響了玉米生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展。玉米種質(zhì)資源中蘊藏有豐富的基因等位變異,通過關聯(lián)分析方法不僅可以檢測到功能單核苷酸多態(tài)性(SNP)變異位點,而且可以發(fā)掘與耐旱密切相關的優(yōu)異等位基因變異,然后根據(jù)基因的變異信息和遺傳變異規(guī)律開發(fā)功能性分子標記,從而用于玉米耐旱分子標記輔助選擇育種中。
　　本研究以我國玉

2、米生產(chǎn)上常用的210份自交系為試驗材料,根據(jù)全基因組關聯(lián)分析結(jié)果,針對與耐旱有關的功能位點進行標記開發(fā),在不同種質(zhì)背景中進行耐旱性驗證。同時,對已經(jīng)鑒定出含耐旱優(yōu)異單倍型的玉米Zmivr2基因,構(gòu)建新型高效表達載體,轉(zhuǎn)化并創(chuàng)制耐旱新品種。獲得的主要研究結(jié)果如下:
　　(1)根據(jù)全基因組關聯(lián)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),有29個SNP位點至少與1個或多個環(huán)境下的2種表型性狀相關聯(lián)并且與耐旱或耐旱響應基因有關。其中,編號為PZA0355.1和PZA0

3、1671.1的SNP更是與多個耐旱性狀表型密切相關。通過生物信息學分析表明PZA0355.1含有G/ASNP變異位點,其注釋基因為dhn1,位于6號染色體;PZA01671.1同樣為A/GSNP變異位點,其注釋基因為rsp41,位于5號染色體。基于這兩個功能SNP變異位點可分別開發(fā)CAPS標記dhnC397和rspC1090,用于分析和驗證不同種質(zhì)材料的耐旱性。
　　(2)在dhnC397標記中,對210份玉米自交系進行基因型驗證

4、,發(fā)現(xiàn)有205份自交系能擴增出大小為164bp目的片段。經(jīng)過StyI酶切后,53份自交系被酶切成大小為131bp和33bp的兩條片段,與此同時138份自交系由于缺少酶切識別位點而未被切開。然后對這205份自交系進行耐旱性綜合評價,將試驗材料分為高度耐旱,耐旱,中等,干旱敏感和高度干旱敏感5種類型。研究發(fā)現(xiàn),在G等位變異自交系中含有7份耐旱自交系和24份旱敏感自交系所占比例分別為12.7％和43.6%;在A等位變異自交系中含33份耐旱自交

5、系和53份旱敏感自交系所占比例分別為23.7%和38.1%。由此看出含A等位變異自交系的耐旱性優(yōu)于G等位變異自交系的耐旱性。通過分析耐旱選擇指標發(fā)現(xiàn)無論屬于哪種等位變異,雜種優(yōu)勢群B的自交系耐旱性要強于雜種優(yōu)勢群A的自交系。
　　(3)在rspC1090標記中,有204份自交系能擴增出286bp大小的目的片段。經(jīng)過HpaII酶切后,108份自交系被酶切成含有225bp和61bp的兩條片段,而有87份自交系沒有被切開。對這204份自

6、交系進行耐旱性評價分析發(fā)現(xiàn)在G等位變異自交系中含有30份耐旱自交系和31份旱敏感自交系分別占比例的27.8%和28.7%;在A等位變異自交系中含10份耐旱自交系和47份旱敏感自交系分別占總比例的11.6%和54.7%。因此,含G等位變異自交系的耐旱性強于含A等位變異的自交系。此外,通過進行耐旱選擇指標分析,同樣發(fā)現(xiàn)屬于雜種優(yōu)勢群B的自交系耐旱性都要強于雜種優(yōu)勢群A的自交系。
　　(4)通過對候選基因Zmivr2關聯(lián)分析,鑒定出優(yōu)異

7、單倍型。在此基礎上進一步研究Zmivr2基因編碼蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)特征。通過SOPMA軟件分析Zmivr2基因蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)該基因主要是由α螺旋(11.74%),延伸鏈(24.07%)和隨機卷曲(64.19%)組成。采用SWISS-MODEL軟件對含優(yōu)異單倍型和普通Zmivr2基因的三級結(jié)構(gòu)進行預測,再用SPDBV4.01軟件對比其三級結(jié)構(gòu)可看出兩者空間結(jié)構(gòu)上存在一定的差異,其中在259處由精氨酸突變?yōu)橘嚢彼?在414處由半胱氨酸突變?yōu)榫?/p>

8、氨酸,因此含優(yōu)異單倍型的Zmivr2基因可能在植物耐旱上起一定的作用。
　　(5)通過In-FusionPCR克隆技術(shù)成功構(gòu)建含有優(yōu)異單倍型的Zmivr2基因植物過表達載體pCUB-ubi-Zmivr2。然后以玉米自交系昌7-2為供體材料進行農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化,經(jīng)PCR檢測有1株為陽性并結(jié)實。將獲得的30粒T1代昌7-2轉(zhuǎn)基因種子種植于溫室待其生長到3-4葉期進行PCR檢測,其中有4株呈現(xiàn)陽性。然后,將收獲的4株陽性株T2代昌7