1、禾谷鐮孢菌（Fusarium graminearum）在生產(chǎn)中主要引起小麥赤霉病、玉米莖基腐病和穗腐病及水稻穗腐病，它不但造成作物產(chǎn)量損失，而且該菌產(chǎn)生的毒素對(duì)作物的品質(zhì)造成嚴(yán)重的降低。主要由禾谷鐮孢菌引起的小麥赤霉病是小麥生產(chǎn)中的一種毀滅性病害，苯并咪唑類殺菌劑如多菌靈是防治小麥赤霉有效的藥劑。當(dāng)前，禾谷鐮孢菌已對(duì)多菌靈產(chǎn)生了嚴(yán)重的抗藥性，小麥赤霉病發(fā)生有愈發(fā)嚴(yán)重的趨勢(shì)，生產(chǎn)中急需防治小麥赤霉病的多菌靈替換藥劑。
　　 通過遺

2、傳轉(zhuǎn)化及基因定點(diǎn)突變技術(shù)，本實(shí)驗(yàn)室已證明了禾谷鐮孢菌對(duì)多菌靈的抗藥性是由其β2-微管蛋白基因突變引起，其突變位點(diǎn)包括F167Y、E198K或E198L、F200Y，50位點(diǎn)突變體也可產(chǎn)生對(duì)多菌靈的低抗。但尚未有從蛋白質(zhì)水平上研究β2-微管蛋白氨基酸突變與多菌靈抗性關(guān)系的報(bào)道。
　　 微管由微管蛋白(tubulin)和微管相關(guān)蛋白（Microtubule associated proteins，MAPs）組成，其中α、β-微管蛋白

3、聚合形成的異源二聚體，是微管的基本單位。α、β-微管蛋白處于一個(gè)聚合/解聚的動(dòng)態(tài)過程，多種以微管蛋白為靶標(biāo)的藥物都是同微管蛋白結(jié)合后抑制了微管的動(dòng)態(tài)過程而發(fā)揮藥理作用的。目前已開發(fā)出基于微管蛋白體外聚合為靶標(biāo)的抗腫瘤藥物篩選模型，但絲狀真菌的微管蛋白還沒有在離體條件下用作殺菌劑創(chuàng)制及篩選的靶標(biāo)。
　　 為了研究禾谷鐮孢菌α、β-微管蛋白的體外聚合反應(yīng)并以此開發(fā)出殺菌劑的離體篩選模型，以及在蛋白水平上理解禾谷鐮孢菌對(duì)多菌靈的抗藥性

4、實(shí)質(zhì)，本文在大腸桿菌中表達(dá)了禾谷鐮孢菌α、β-微管蛋白，并進(jìn)行了體外聚合及藥劑結(jié)合研究，結(jié)果如下:
　　 以禾谷鐮孢菌cDNA為模板，PCR擴(kuò)增出α1、α2-微管蛋白基因，將其克隆到pET30a+表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)化到宿主菌Rossatta(DE3)pLysS，篩選陽性克隆，進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE及Western-blot結(jié)果表明:融合蛋白主要以包涵體形式存在，分子量約為52.1 kD和55.9 kD;融合蛋白能與抗Hi

5、s-tag的單抗發(fā)生特異性反應(yīng)。通過對(duì)包涵體洗滌及透析復(fù)性后采用HisTrapTMHP Columns對(duì)融合蛋白進(jìn)行純化，可以得到純度較高的微管蛋白。
　　 以構(gòu)建好的(pET32a-β2-tubulin)重組質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增出β2-微管蛋白基因，將其克隆到pET30a+表達(dá)載體上，并轉(zhuǎn)化到宿主菌BL21(DE3)及Rossatta(DE3)pLysS，篩選陽性克隆，進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)表達(dá)，并篩選蛋白可溶性表達(dá)的誘導(dǎo)因子;對(duì)純化

6、后的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE和Western Blot驗(yàn)證。最終獲得了在大腸桿菌中表達(dá)效率高的陽性克隆;通過對(duì)誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)物濃度、誘導(dǎo)時(shí)間、初始誘導(dǎo)時(shí)的菌液濃度、培養(yǎng)液、誘導(dǎo)物種類及宿主菌等七因子的綜合分析，獲得了β2-微管蛋白可溶性表達(dá)的誘導(dǎo)條件;利用HisTrapTM HP Columns對(duì)β2-微管蛋白進(jìn)行純化，可獲得純度很高的可溶性β2-微管蛋白。SDS-PAGE確認(rèn)表達(dá)出的融合蛋白分子量約為51.6 kD;Western-b

7、lot證實(shí)表達(dá)的融合蛋白能與His-tag及β-微管蛋白的單克隆抗體發(fā)生特異性反應(yīng)。
　　 通過改變誘導(dǎo)條件獲得禾谷鐮孢菌可溶性的α-微管蛋白，包括降低誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)物濃度，延長誘導(dǎo)時(shí)間。誘導(dǎo)條件改變對(duì)α-微管蛋白總量無影響，但可使包涵體中的蛋白量下降而上清中可溶性的蛋白量增加，其中上清中α1-微管蛋白的增加量較α2-微管蛋白多，說明α1-微管蛋白在大腸桿菌里更容易可溶性表達(dá)。利用HisTrapTM HPColumns對(duì)融合蛋白

8、進(jìn)行純化，可獲得純度很高的可溶性α-微管蛋白;Western-blot證實(shí)表達(dá)的融合蛋白能與His-tag及α-微管蛋白的單克隆抗體發(fā)生特異性反應(yīng)，說明α-微管蛋白在提取及純化過程中始終保持著結(jié)構(gòu)上的完整性。
　　 研究了禾谷鐮孢菌微管蛋白的體外聚合反應(yīng)。微管蛋白純化后經(jīng)過透析、濃縮，可以在體外無微管相關(guān)蛋白下發(fā)生聚合反應(yīng)。聚合的條件是:反應(yīng)在Pipes buffer中進(jìn)行，微管蛋白濃度1 mg·mL-1，GTP濃度2mmol·

9、L-1;反應(yīng)溫度37℃，反應(yīng)時(shí)間60m，DMSO對(duì)聚合無影響;聚合在96孔酶標(biāo)板上進(jìn)行，在酶標(biāo)儀350nm處測(cè)定反應(yīng)60m之內(nèi)的吸光度，每隔12s讀數(shù)一次。結(jié)果表明:α2、β2-微管蛋白的聚合程度比α1、β2-微管蛋白聚合程度強(qiáng);多菌靈加入可顯著地抑制α1、β2或α2、β2-微管蛋白的聚合，但對(duì)已發(fā)生聚合的微管無作用;多菌靈對(duì)微管蛋白體外聚合的抑制同其活體條件下對(duì)出發(fā)菌株的抑菌效果相同。幾類藥物對(duì)α、β2-微管蛋白聚合的影響不同，同其活

10、體抑菌活性也不完全一致，表明禾谷鐮孢菌α1、β2-微管蛋白的體外聚合反應(yīng)可用在藥物的初步篩選中。
　　 在大腸桿菌中利用pET32a+成功表達(dá)了禾谷鐮孢菌不同抗性菌株的β2-微管蛋白，改變誘導(dǎo)條件，使β2-微管蛋白得到了可溶性表達(dá)并進(jìn)行了自然條件下的純化。不同位點(diǎn)的氨基酸突變對(duì)融合蛋白表達(dá)總量及可溶性蛋白表達(dá)量無明顯差異。純化的β2-微管蛋白對(duì)His-tag及β-微管蛋白單克隆抗體均有反應(yīng)，說明蛋白在提取及純化過程中一直保持著結(jié)

11、構(gòu)完整性。盡管pET32a+表達(dá)出的融合蛋白N端有大約17.3kD的標(biāo)簽蛋白，但同α-微管蛋白體外聚合特性與pET30a+表達(dá)的融合蛋白無差異，多菌靈對(duì)聚合的影響也相同，說明N端的標(biāo)簽蛋白對(duì)β2-微管蛋白與α1-微管蛋白體外聚合無影響。不同抗性菌株β2-微管蛋白與α1-微管蛋白的體外聚合存在著顯著差異，198位突變導(dǎo)致聚合程度加強(qiáng);但多菌靈對(duì)抗性菌株β2-微管蛋白與α1-微管蛋白的體外聚合無影響，表明β2-微管蛋白發(fā)生點(diǎn)突變后與多菌靈的

12、親和力降低。
　　 采用熒光淬滅的方法研究了禾谷鐮孢菌β-微管蛋白及不同抗性菌株β2-微管蛋白同多菌靈的體外親和性。多菌靈對(duì)所有的融合蛋白都具有熒光淬滅效應(yīng)，對(duì)敏感菌株β2-微管蛋白的熒光淬滅率最高，對(duì)雙位點(diǎn)突變菌株(52-7)β2-微管蛋白熒光淬滅率最低，但對(duì)中抗菌株β2-微管蛋白的淬滅率低于高抗菌株JT04和點(diǎn)突變體E198K。藥劑平衡試驗(yàn)表明，微管蛋白濃度2μmol·L-1，多菌靈濃度在20μmol·L-1時(shí)對(duì)融合蛋白的熒

13、光淬滅率達(dá)到最大值，故選取該濃度進(jìn)行藥劑動(dòng)力學(xué)研究。結(jié)果表明:β2-微管蛋白與多菌靈的體外結(jié)合速率和出發(fā)菌株對(duì)多菌靈的抗性水平呈負(fù)相關(guān)，抗性水平高的菌株有較低的結(jié)合速率Kon;而解離速率Koff則同抗性水平呈正相關(guān)，抗性水平高解離速率大;親和常數(shù)Ka同多菌靈抗性水平呈負(fù)相關(guān)，敏感菌株的β2-微管蛋白與多菌靈的親和常數(shù)大于抗性菌株的。β1-微管蛋白與多菌靈的親和常數(shù)Ka介于敏感菌株β2-微管蛋白和低抗點(diǎn)突變體Y50Cβ2-微管蛋白之間，表