副豬嗜血桿菌LAMP快速檢測方法的建立.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、副豬嗜血桿菌(Haemophlius parasuis,Hps)危害嚴重,是目前養(yǎng)豬業(yè)的多發(fā)病之一,建立快速準確的診斷方法,及時采取相應的防治措施是防治成功的關鍵。但是副豬嗜血桿菌分離難度較大,常規(guī)的檢測方法比較繁瑣,且需要昂貴的儀器設備,很難在基層推廣。而環(huán)介導等溫擴增技術(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)簡單方便,不需要特殊設備,所以建立基于LAMP的副豬嗜血桿菌的快速檢測方

2、法十分必要,在臨床檢測中的應用潛力非常大。
  本研究通過比對GengBank中已發(fā)表的Hps16S rRNA序列,找出其高度保守區(qū)域,以此為靶基因并針對其6個特異性區(qū)域設計出4條特異性引物:兩條外引物 F3、B3和兩條內引物 FIP、BIP,利用 Bst DNA聚合酶的鏈置換作用對Hps進行 LAMP擴增反應,通過優(yōu)化反應體系和反應條件建立了 Hps的LAMP快速檢測方法,并檢測該方法的靈敏性與特異性。
  1.最佳反應體

3、系的篩選
  通過設置單因素梯度變化分別對反應體系中的內外引物比( F3∶FIP, B3∶BIP)、Mg2+終濃度、dNTPs終濃度進行優(yōu)化,內引物比梯度為1∶1、1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10,Mg2+終濃度梯度為0 mM、2 mM、4 mM、6 mM、8 mM、10 mM,dNTPs終濃度梯度為0 mM、1 mM、2 mM、3 mM、4 mM、5 mM。最終確立了LAMP反應的最佳反應體系:外引物各0.2μM,內引物

4、各0.8μM,Mg2+終濃度為6 mM,dNTPs終濃度為3 mM,10×ThermoPol緩沖液2.5μL,Bst DNA聚合酶1μL,模板1μL,補水至25μL。
  2.最佳反應條件的優(yōu)化
  通過設置單因素梯度變化分別對反應溫度和反應時間進行優(yōu)化,反應溫度梯度為60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃,反時間梯度為30 min、40 min、50 min、60 min、70 min。結果顯示反應在63℃

5、條件下1 h即可完成。
  3. LAMP靈敏性檢測
  對Hps基因組DNA進行10-n倍梯度稀釋,以100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8倍稀釋的基因組為模板分別進行常規(guī) PCR反應和 LAMP反應,通過比較兩種反應的檢測結果來反映 LAMP反應的敏感性。結果顯示LAMP方法敏感性是PCR的100倍,最低檢出量為0.241 pg/μL。
  4. LAMP特異性檢測<

6、br>  分別以副豬嗜血桿菌、豬鏈球菌( Streptococcus suis)、沙門氏菌( Salmonella enteriditis)、大腸桿菌( Escherichia coli)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)、金黃色葡萄球菌(Staphylocococcus aureus)為模板,用本研究所建立的方法進行LAMP反應,驗證

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