1、副豬嗜血桿菌的病原學(xué)檢測RESEARCH ON DETECTION OF HAEMOPHILUS PARASUIS,,匯報(bào)內(nèi)容,研究背景 研究的主要內(nèi)容 結(jié)果與分析 小結(jié),研究背景,隨著我國規(guī)?；B(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，副豬嗜血桿菌感染有明顯增加趨勢，已成為豬場保育仔豬發(fā)病率和死亡率增加的重要原因之一，造成重大經(jīng)濟(jì)損失。由于需要從病原學(xué)角度證實(shí)，而我國缺乏用于副豬嗜血桿菌檢測的標(biāo)準(zhǔn)血清及診斷方法，因此我們開展相關(guān)研究。,解

2、決方法,1 分離鑒定副豬嗜血桿菌。進(jìn)行副豬嗜血桿菌的流行病學(xué)調(diào)查，從而生產(chǎn)相對于主要流行優(yōu)勢菌株的疫苗。建立副豬嗜血桿菌的快速診斷方法，為控制該病提供前提。,研究的主要內(nèi)容,1．病原的分離鑒定。2．標(biāo)準(zhǔn)血清、分型方法的建立和臨床應(yīng)用。3．轉(zhuǎn)鐵結(jié)合蛋白PCR診斷方法的建立和臨床應(yīng)用。,第一章 副豬嗜血桿菌的分離鑒定,病料采集　　　　剖檢樣品的病變表現(xiàn)為胸膜炎、心包炎、腹膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎等。我們采集病變的肺臟和扁桃

3、體作為病原分離的樣本。病原菌分離方法 　　　 在無菌操作條件下從疑似病豬的肺臟和扁桃體等病料中取樣, 在巧克力瓊脂平板或TSA培養(yǎng)基上劃線接種, 37 ℃培養(yǎng)48 h后挑取單個(gè)菌落,轉(zhuǎn)接相同的培養(yǎng)基再進(jìn)行純培養(yǎng)。涂片鏡檢 挑取上述純培養(yǎng)菌落涂片,革蘭氏染色后觀察細(xì)菌形態(tài)。,,分離鑒定兩株副豬嗜血桿菌,,分離菌株溶血性測定,16s rRNA－ PCR鑒定,兩株副豬嗜血的血清型鑒定,用本實(shí)驗(yàn)室制備的Hps標(biāo)

4、準(zhǔn)陽性血清對本地分離菌株進(jìn)行血清型鑒定。(1) 瓊脂擴(kuò)散方法：湖北分離株血清型為5型，湖南分離株則未能檢測出血清型。(2) 間接血凝抑制方法: 檢測出湖北分離株的血清型為5型，湖南分離株的血清型為13型。,分析與討論,對于Hps 分離較為困難, 需要在典型新鮮病料的采集、適宜的培養(yǎng)條件及分離者的判斷經(jīng)驗(yàn)上更為關(guān)注, 才能提高其臨床分離率。這兩株副豬嗜血桿菌分離株對麥芽糖、葡萄糖、蜜三糖、木糖、阿拉伯糖、D-核糖、接觸酶、

5、氧化酶、甘露醇、山梨糖、乳糖、尿素酶反應(yīng)表現(xiàn)為一致,但對蔗糖、半乳糖、果糖、和H2S、山梨醇、甘露糖的生化反應(yīng)不一致。,,第二章 副豬嗜血桿菌的血清學(xué)分型方 法的建立和臨床應(yīng)用,,標(biāo)準(zhǔn)抗原制備,,制備,分離株分型,標(biāo)準(zhǔn)陽性血清,家兔免疫,,分型方法的建立,,檢測抗原的制備,鹽析抗原(Salt Antigen)含菌量為1.8×109 CFU/mL 煮沸抗原(Boiled Antigen)含菌量為3

6、×109 CFU/mL熱穩(wěn)定抗原（Heat-stable Antigen）含菌量為1.8×109/mL,結(jié)果分析,免疫后抗體產(chǎn)生的規(guī)律(Hps-5、Hps-1為例),抗血清效價(jià)檢測,抗血清的在兩種檢測方法中的特異性,抗血清的保存期測定,將所保存的不同時(shí)期的Hps-5抗血清用于玻片凝集試驗(yàn)。,分離株的鑒定,將保存的96株副豬嗜血桿菌制作成相應(yīng)的熱穩(wěn)定分型抗原，利用本試驗(yàn)制備標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，采用瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)進(jìn)行分型。

7、,分析與討論,標(biāo)準(zhǔn)副豬嗜血桿菌在家兔內(nèi)產(chǎn)生抗體的強(qiáng)弱。 本研究中探索了瓊脂擴(kuò)散方法和玻片凝集方法在副豬嗜血桿菌血清分型中的應(yīng)用。三種分型抗原在瓊脂擴(kuò)散分型方法的應(yīng)用。,第三章 副豬嗜血桿菌轉(zhuǎn)鐵結(jié)合蛋白 PCR診斷方法的建立和臨床應(yīng)用,副豬嗜血桿菌轉(zhuǎn)鐵結(jié)合蛋白tbpB保守序列的篩選標(biāo)準(zhǔn)副豬嗜血桿菌（15個(gè)血清型）tbpB的檢測該方法靈敏性、特異性檢測人工感染病料和臨床病料的檢測討論分析,,副豬嗜血桿菌轉(zhuǎn)鐵

8、結(jié)合蛋白tbpB保守序列的選用,將tpbB-PCR檢測的目的片段在NCBI網(wǎng)站上經(jīng)過BLAST比對后發(fā)現(xiàn)，該基因5’端225bp到514bp（288個(gè)nt）片段在大部分Hps中保守．,不同血清型副豬嗜血桿菌tbpB的檢測,對15種血清型的標(biāo)準(zhǔn)Hps進(jìn)行擴(kuò)增，由結(jié)果可知1、3、4、 5、6、7、8 、11 、12、13、15型菌株均能通過本實(shí)驗(yàn)檢測，而9、10、14型菌株未被檢測出此目的帶。,靈敏性試驗(yàn),將Hps-5型標(biāo)準(zhǔn)菌株的培養(yǎng)后，

9、用比濁管測定，菌液濃度為1.25×109 CFU/mL，模板稀釋倍數(shù)依次為100、101、102、103、104、105、106、107、108、109后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖5所示。可見陽性結(jié)果的最高稀釋度為稀釋105倍，后取2μL 做為模板，因此推算出PCR反應(yīng)中最低檢測量為25 CFU/mL。,特異性試驗(yàn),僅有Hps(lane1,3)擴(kuò)增出目的帶，而多殺性巴氏桿菌（lane 4） ，大腸桿菌（lane

10、 5）,沙門氏菌（lane 6）為PCR陰性，如圖6。該方法在檢測豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株過程中，僅在血清型9型中擴(kuò)增出微弱目的帶，其余為陰性，如圖7。,人工感染病樣的檢測,選擇豬副豬嗜血桿菌抗體陰性30日齡的豬，攻毒后收集豬死亡后的肺和腦，置-20℃保存?zhèn)溆? 作為陽性材料；對照豬在3d后撲殺，采集肺和腦，置-20℃保存?zhèn)溆?，作為陰性材料。圖8為從組織病料中直接提取該菌基因的結(jié)果。圖9為病料中細(xì)菌過夜培養(yǎng)后提取的基因組的檢測結(jié)

11、果。,臨床病料中檢測的結(jié)果,對送檢的18份臨床病料進(jìn)行tpbB-PCR檢測　　　7、 14號(hào)樣品中出現(xiàn)288bp的目的帶。,臨床病料的16S rRNA-PCR檢測結(jié)果,在相應(yīng)的16S rRNA檢測過程中，7、14號(hào)樣品中出現(xiàn)821bp的目的帶,分析與討論,為了評估tbpB-PCR方法的特異性，12種血清型的APP和多殺性巴氏桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌一些其他的菌株被用于實(shí)驗(yàn)，結(jié)果11個(gè)血清型的APP和一些其它菌株的檢測結(jié)果均為陰性，這有

12、力證明了我們所確定的tbpB的序列在Hps中的保守性。 實(shí)驗(yàn)比較了2種不同的模板制作方法，一種是碾磨病料，直接提取病菌的全基因組作為模板。第二種是將小塊病料在TSB液體中過夜培養(yǎng)，煮菌，離心后提取上清作為模版。結(jié)果顯示第二種方法制做模板所檢測的效果明顯優(yōu)于第一種方法。因此我們認(rèn)為該方法靈敏性較高，模板制作方法簡單，更加適用于臨床病料的檢測。根據(jù)文獻(xiàn)介紹，Hps多定居在鼻腔和扁桃體，所以我們在采集病料過程中也應(yīng)該注意這一點(diǎn)，這也會(huì)

13、影響到我們檢測該菌的敏感度。,小 結(jié),從病料中分離鑒定了2株副豬嗜血桿菌。制備了15個(gè)血清型的副豬嗜血桿菌標(biāo)準(zhǔn)陽性血清及對96株Hps進(jìn)行了血清型分型。 對不同血清型tbpB基因進(jìn)行了調(diào)查并建立了副豬嗜血桿菌tbpB-PCR檢測方法，為本病的診斷提供了有力工具。,相關(guān)研究文章,1 王磊，何啟蓋，蔡旭旺，陳煥春，劉正飛，P.J. Blackall．副豬嗜血桿菌標(biāo)準(zhǔn)抗血清的制備及臨床應(yīng)用．中國獸醫(yī)雜志（在投）

14、2. Cai X, Chen H, Blackall PJ, Yin Z, Wang L, Liu Z, Jin M. Serological characterization of Haemophilus parasuis isolates from China. Veterinary Microbiology, 2005,111( 3-4): 231-236,致 謝,感謝指導(dǎo)老師何啟蓋教授對我課題的指導(dǎo)！感謝實(shí)驗(yàn)室全體同學(xué)

15、對我的支持與幫助！本研究是在湖北省自然科學(xué)基金創(chuàng)新團(tuán)體項(xiàng)目(2001ABA19)資助完成的。,感謝評審老師對我論文的評閱！請各位老師多提寶貴意見！謝謝大家！,Hps標(biāo)準(zhǔn)陽性血清的制備,免疫原的制備每種血清型標(biāo)準(zhǔn)菌株分別免疫3只家兔。免疫程序首次免疫用0.5毫升（含菌量為109CFU）與等量的福氏不完全佐劑充分混合，在頸背部皮下分四點(diǎn)注射兔子。兩個(gè)星期后,將菌液濃度增至4×109 CFU/mL，再與等量的福