1、反芻動(dòng)物瘤胃甲烷的排放，既意味著可被動(dòng)物消化能量的損失，又導(dǎo)致了大氣中溫室氣體的增加，因此減緩瘤胃甲烷生成已經(jīng)越來(lái)越引起人們的重視。延胡索酸是瘤胃中的重要中間代謝產(chǎn)物，可作為電子受體用于抑制甲烷生成。本論文系統(tǒng)研究了延胡索酸二鈉調(diào)控瘤胃甲烷生成的微生物學(xué)機(jī)理及延胡索酸還原菌的多樣性。首先建立了檢測(cè)瘤胃微生物代謝產(chǎn)物中的有機(jī)酸含量的高效液相色譜分析方法，為分析瘤胃微生物的代謝狀況提供了可靠的分析手段;其次研究了在不同精粗比條件下添加延胡索

2、酸二鈉對(duì)山羊血清生化指標(biāo)、甲烷生成、瘤胃發(fā)酵、瘤胃微生物區(qū)系組成及重要微生物數(shù)量的影響，從多個(gè)角度揭示了延胡索酸二鈉調(diào)控瘤胃甲烷生成的機(jī)理;再就是利用編碼延胡索酸還原酶的功能基因frdA基因研究了瘤胃延胡索酸還原菌的多樣性;利用體外繼代培養(yǎng)結(jié)合16S rRNA克隆庫(kù)的方式研究了可培養(yǎng)延胡索酸利用菌在體外繼代培養(yǎng)過(guò)程中的變化規(guī)律;最后通過(guò)厭氧滾管技術(shù)分離到兩株延胡索酸還原菌并對(duì)其進(jìn)行了形態(tài)學(xué)、生理生化特性以及16S rRNA序列鑒定。本研

3、究試驗(yàn)共分為五個(gè)部分:
　　 1、建立高效液相色譜法檢測(cè)瘤胃微生物代謝產(chǎn)物中的有機(jī)酸
　　 建立了一種同時(shí)快速分析瘤胃微生物發(fā)酵液中7種有機(jī)酸的高效液相色譜法。該方法采用色譜級(jí)甲醇和20 mM磷酸氫二鈉緩沖液（用磷酸調(diào)pH至2.7，v∶v=1∶99）作為流動(dòng)相，流速采用二元泵梯度程序洗脫方法控制，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為215n，柱溫為30℃，能夠快速、準(zhǔn)確地分離和測(cè)定瘤胃微生物發(fā)酵液中的甲酸、乙酸、丙酸、延胡索酸、琥珀酸、蘋果酸

4、、乳酸。方法的回收率為96.40％～99.60％，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.50％～4.40％，各種有機(jī)酸的線性相關(guān)系數(shù)均大于0.9993，具有較高的精密度和準(zhǔn)確度，可以用于瘤胃微生物發(fā)酵液中的有機(jī)酸分析。
　　 2、不同精粗比條件下添加延胡索酸二鈉對(duì)山羊血清生化指標(biāo)、甲烷生成、瘤胃發(fā)酵、微生物區(qū)系組成及重要微生物數(shù)量的影響
　　 選用4只體重約為24±1.43kg、裝有永久瘺管的本地雜交閹公羊，采用2×2兩因子析因設(shè)計(jì)，按一個(gè)

5、4×4拉丁方排序，以日糧精粗比（粗料:精料分別為41∶59或57.6∶42.4）和延胡索酸二鈉添加量（0 g/天或10g/天）作為主要影響因子，研究不同精粗比條件下添加延胡索酸二鈉對(duì)山羊血清生化指標(biāo)、瘤胃發(fā)酵、甲烷生成、微生物區(qū)系組成及重要菌群數(shù)量變化的影響。結(jié)果顯示，日糧精粗比和延胡索酸二鈉對(duì)血糖、甘油三酯、膽固醇、尿素氮、乳酸的濃度以及谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、乳酸脫氫酶的酶活無(wú)顯著影響，說(shuō)明添加延胡索酸對(duì)山羊健康沒(méi)有明顯影響。與未添

6、加延胡索酸二鈉的對(duì)照組相比，添加延胡索酸二鈉顯著降低了甲烷產(chǎn)量（P＜0.05），飼喂高精料和高粗料日糧的山羊甲烷產(chǎn)量分別降低了8.10％、15.76％。與未添加延胡索酸二鈉的對(duì)照組相比，飼喂延胡索酸二鈉組的山羊瘤胃內(nèi)總揮發(fā)性脂肪酸、乙酸、丙酸濃度顯著增加（P＜0.05）。DGGE分析結(jié)果表明，不同日糧精粗比條件下添加延胡索酸二鈉對(duì)瘤胃細(xì)菌及甲烷菌區(qū)系組成沒(méi)有顯著影響;飼喂延胡索酸二鈉的山羊瘤胃內(nèi)的產(chǎn)甲烷菌數(shù)量要低于未添加延胡索酸二鈉組（

7、P＜0.05）。添加延胡索酸二鈉組中的反芻獸新月形單胞菌（一種延胡索酸還原菌）的數(shù)量要顯著高于未添加延胡索酸二鈉的對(duì)照組，但僅限于高粗料條件下（P＜0.05）。日糧精粗比與延胡索酸二鈉之間對(duì)于反芻獸新月形單胞菌的影響存在顯著交互作用(P＜0.05)。真菌、原蟲(chóng)、黃色瘤胃球菌和產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌的數(shù)量不受延胡索酸二鈉添加劑量的影響。日糧的精粗比的變化對(duì)于產(chǎn)甲烷菌、真菌和黃化瘤胃球菌影響顯著（P＜0.05），但是對(duì)甲烷產(chǎn)量（g/天）無(wú)顯著影響

8、。這結(jié)果提示延胡索酸二鈉對(duì)山羊瘤胃發(fā)酵具有有益作用，結(jié)果也進(jìn)一步提示延胡索酸二鈉的效果不是直接作用于真菌、原蟲(chóng)和主要的纖維降解菌，而是由于它促進(jìn)了延胡索酸還原菌的生長(zhǎng)，抑制了產(chǎn)甲烷菌的生長(zhǎng)。其中一些指標(biāo)的變化，如反芻獸新月型單胞菌的數(shù)量等，與日糧精粗比的變化相關(guān)，這說(shuō)明了延胡索酸二鈉對(duì)甲烷的抑制效果可能與日糧的精粗比相關(guān)。
　　 3、利用frdA基因研究延胡索酸還原菌的多樣性
　　 雖然瘤胃延胡索酸還原菌對(duì)于降低甲烷生成

9、可能具有重要作用，但是目前關(guān)于在山羊瘤胃內(nèi)的延胡索酸還原菌的多樣性的研究卻仍不清楚。本研究利用構(gòu)建延胡索酸還原酶frdA基因克隆庫(kù)的方式來(lái)分析多種日糧條件下（高精料或高粗料，精粗比分別為41∶59或57.6∶42.4，兩種日糧均添加0或10 g/天延胡索酸二鈉）山羊瘤胃內(nèi)Proteobacteria門延胡索酸還原菌的多樣性。RFLP分析結(jié)果表明206個(gè)陽(yáng)性克隆可分為24個(gè)分類操作單元(OTU)，表明延胡索酸還原菌的多樣性非常高;frdA

10、擴(kuò)增序列所推導(dǎo)的氨基酸與已知氨基酸序列的相似性范圍為75％～93％，這意味著瘤胃內(nèi)存在許多未知的延胡索酸還原菌。它們均屬于Proteobacteria;系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明，這些序列在遺傳距離上相距較遠(yuǎn)。
　　 4、體外繼代培養(yǎng)研究山羊瘤胃延胡索酸利用菌的變化規(guī)律
　　 采用PCR-DGGE結(jié)合16S rRNA克隆庫(kù)技術(shù)，研究了山羊瘤胃內(nèi)容物中延胡索酸利用菌菌群在體外傳代過(guò)程中的變化規(guī)律。PCR-DGGE的分析結(jié)果表明，隨

11、繼代培養(yǎng)次數(shù)的增加，細(xì)菌DGGE圖譜上的條帶數(shù)逐漸變少，一些條帶(A、B、C、E、F、G、H)消失，一部分一直存在(D、O、P、Q、R、S)，而部分條帶明顯得到富集(I、J、K、L、M、N)。繼代培養(yǎng)5次后細(xì)菌條帶數(shù)趨于穩(wěn)定。16Sr RNA基因測(cè)序比對(duì)結(jié)果表明，所獲得的88個(gè)克隆中，6個(gè)克隆屬于Fusobacterium varium（相似性＞97％），占克隆的6.82％;42個(gè)克隆屬于Wolinella succinogenes（相

12、似性＞97％），占克隆的47.73％;4個(gè)克隆屬于Clostridium cochlearium（相似性＞97％），占克隆的4.55％;10個(gè)克隆屬于Bacteroides pyogenes（相似性＞97％），占克隆的11.36％;8個(gè)克隆屬于Agrobacterium tumefaciens（相似性＞97％），占克隆的9.09％;2個(gè)克隆屬于Oribacterium sinus（相似性＜97％），占克隆的2.27％;3個(gè)克隆屬于Clo

13、stridiumsubterminale(相似性＞97％)，占克隆的3.41％;3個(gè)克隆屬于Fusobacterium naviforme（相似性＜97％），占克隆的3.41％;10個(gè)克隆屬于Clostridium hastiforme(相似性＞97％)，占克隆的11.36％。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明，它們分別屬于Clostridiales、Fusobacteriales、Rhizobiales、Campylobacterales、Bacte

14、roidales。以上結(jié)果說(shuō)明，混合瘤胃內(nèi)容物中存在大量的延胡索酸利用菌，它們可能會(huì)參與瘤胃延胡索酸還原過(guò)程，添加延胡索酸可起到體外富集延胡索酸還原菌的作用。
　　 5、山羊瘤胃延胡索酸利用菌的分離、鑒定
　　 通過(guò)厭氧滾管法從健康山羊瘤胃內(nèi)容物中分離得到了兩株瘤胃厭氧細(xì)菌，分別命名為Y1和Y10。經(jīng)HPLC法檢測(cè)它們對(duì)延胡索酸二鈉的代謝情況可知，它們都能夠利用延胡索酸生成琥珀酸并進(jìn)一步形成丙酸。經(jīng)形態(tài)學(xué)和生理生化特性分

15、析，初步鑒定Y1屬于埃希氏菌屬，Y10屬于變形桿菌屬。將兩株菌的16 S rRNA序列與GenBank中的已知序列相比較，其與Escherichia coli、 Proteus mirabilis的相似性高達(dá)99％，進(jìn)一步確定所分離到的菌株Y1為埃希氏菌屬弗氏埃希氏菌（Escherichia fergusonii），Y10為奇異變形桿菌(Proteus mirabilis)。經(jīng)RDP數(shù)據(jù)庫(kù)分類比較，它們均屬于變形桿菌（Proteobac