1、海洋產(chǎn)品魚(yú)油和微藻能夠有效的抑制瘤胃中不飽和脂肪酸的氫化，提高反芻動(dòng)物產(chǎn)品中多不飽和脂肪酸的含量。研究認(rèn)為DHA和EPA這兩種多不飽和脂肪酸是其中的關(guān)鍵活性成分。但是過(guò)去的研究使用的魚(yú)油和微藻其脂肪酸組成復(fù)雜，不能準(zhǔn)確反映DHA和EPA的作用機(jī)制。本研究以山羊?yàn)樵囼?yàn)動(dòng)物，采用純度較高的DHA和EPA進(jìn)行在體試驗(yàn)。本論文報(bào)告了DHA、 EPA對(duì)瘤胃微生物和瘤胃脂肪酸組成的影響。
　　 1.體外與體內(nèi)瘤胃微生物發(fā)酵特性與菌群結(jié)構(gòu)的差

2、異研究
　　 本試驗(yàn)以兩頭裝有瘤胃瘺管的波爾雜交山羊?yàn)樵囼?yàn)動(dòng)物，在全粗料日糧及50％精料條件下，利用基于16S rRNA基因的變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術(shù)，比較研究了體內(nèi)和體外培養(yǎng)條件下細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)與微生物發(fā)酵代謝的情況。DGGE分析結(jié)果顯示，瘤胃內(nèi)細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)和體外培養(yǎng)條件下細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)組成在2h開(kāi)始出現(xiàn)差異，全粗料條件下瘤胃內(nèi)細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)和體外培養(yǎng)體系細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)相似性不超過(guò)55％，體外培養(yǎng)體系中細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)隨著發(fā)酵時(shí)間

3、延長(zhǎng)細(xì)菌菌落多樣性下降，細(xì)菌菌落結(jié)構(gòu)趨于簡(jiǎn)單化。揮發(fā)性脂肪酸分析顯示，瘤胃中丁酸所占總揮發(fā)性脂肪酸的比率低于體外培養(yǎng)的，差異極顯著（P＜0.01）。50％精料條件下體外培養(yǎng)2h后細(xì)菌菌落結(jié)構(gòu)與瘤胃內(nèi)的相似性不到70％，12h后RBC與CRBC相似性小于60％，體外培養(yǎng)體系中細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)細(xì)菌菌落多樣性下降，細(xì)菌菌落結(jié)構(gòu)趨于簡(jiǎn)單化。瘤胃中乙酸所占總揮發(fā)性脂肪酸的比率高于體外培養(yǎng)的，差異極顯著(P＜0.01);丙酸和丁酸所占總

4、揮發(fā)性脂肪酸的比率低于體外培養(yǎng)的，差異極顯著(P＜0.01)。試驗(yàn)結(jié)果提示，體內(nèi)和體外條件下瘤胃細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)不同，菌群結(jié)構(gòu)差異在2h內(nèi)出現(xiàn)，這種菌群結(jié)構(gòu)差異可能導(dǎo)致了微生物代謝的差異，進(jìn)而使得體外培養(yǎng)不能準(zhǔn)確反映瘤胃內(nèi)微生物整體的生長(zhǎng)代謝情況。
　　 2.瘤胃灌注DHA對(duì)山羊瘤胃脂肪酸組成和微生物的影響
　　 本試驗(yàn)采用4×4拉丁方設(shè)計(jì)，以4頭裝有永久瘤胃瘺管的山羊?yàn)閷?shí)驗(yàn)動(dòng)物，研究了瘤胃灌注DHA0 g/d，2.5 g/

5、d、5g/d、10g/d對(duì)山羊瘤胃脂肪酸組成和瘤胃微生物的影響。血液生化指標(biāo)分析結(jié)果表明，山羊瘤胃灌注DHA顯著提高了血漿甘油三酯的含量(P＜0.05)，對(duì)山羊血液中的葡萄糖，高密度脂肪酸，低密度脂肪酸，總膽固醇，血漿尿素氮沒(méi)有顯著影響。瘤胃發(fā)酵參數(shù)分析顯示添加DHA顯著降低了瘤胃乙酸、丁酸、總揮發(fā)酸及氨態(tài)氮濃度（P＜0.01）;顯著提高了瘤胃pH值（P＜0.01），丙酸濃度(P＜0.01）和瘤胃微生物蛋白濃度(P＜0.05)。脂肪酸組

6、成分析表明，DHA顯著降低了瘤胃中飽和脂肪酸如C15∶0、C16∶0、C17∶0及C18∶0（P＜0.01）的含量;顯著提高了瘤胃中單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸如cis-9，trans-11，trans-9，cis-12 CLA及trans-11 C18∶1的含量（P＜0.01）。對(duì)瘤胃細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)的DGGE分析結(jié)果顯示，DHA對(duì)山羊瘤胃細(xì)菌多樣性沒(méi)有顯著影響，但一些優(yōu)勢(shì)條帶隨著DHA添加量的提高而逐漸消失。16S rRNA基因序列分

7、析表明，與這些條帶相對(duì)應(yīng)的最相似菌菌為瘤胃中未可培養(yǎng)細(xì)菌。對(duì)瘤胃微生物特別是氫化相關(guān)細(xì)菌的定量分析結(jié)果顯示:山羊瘤胃灌注DHA顯著降低了瘤胃總細(xì)菌及B.proteoclasticus的數(shù)量（P＜0.01），對(duì)Butyrivibrio.spp數(shù)量和原蟲(chóng)數(shù)量沒(méi)有影響;顯著提高了瘤胃真菌數(shù)量(P＜0.01)，原蟲(chóng)計(jì)數(shù)結(jié)果表明DHA對(duì)山羊瘤胃原蟲(chóng)數(shù)量沒(méi)有影響。一般線性回歸分析顯示C18∶3，C18∶2，C18∶1分別與Butyrivibrio數(shù)

8、量沒(méi)有相關(guān)性（P＞0.05），C18∶0與B.proteoclasticus的數(shù)量呈正相關(guān)(P＜0.01，R2=0.93)。結(jié)果提示，DHA改變了瘤胃中微生物菌群結(jié)構(gòu)，影響了瘤胃微生物代謝，從而抑制了瘤胃不飽和脂肪酸的氫化;瘤胃中某些未知的細(xì)菌在瘤胃氫化過(guò)程中發(fā)揮作用。
　　 3.瘤胃灌注EPA對(duì)山羊瘤胃脂肪酸組成和微生物的影響
　　 采用4×4拉丁方設(shè)計(jì)，研究了EPA（0g/d，2.5g/d、5g/d、10g/d）對(duì)山

9、羊瘤胃脂肪酸組成扣瘤胃微生物的影響。血液生化指標(biāo)分析結(jié)果表明，山羊瘤胃灌注EPA降低了山羊血液中的葡萄糖及高密度脂蛋白的含量（P＜0.05）;提高了血漿尿素氮的含量(P＜0.05);對(duì)低密度脂肪酸，總膽固醇，甘油三酯沒(méi)有顯著影響。瘤胃發(fā)酵參數(shù)分析結(jié)果顯示，EPA降低了瘤胃乙酸濃度和氨態(tài)氮濃度(P＜0.01);提高了丙酸(P＜0.01)微生物蛋白濃度（P＜0.05）;對(duì)瘤胃pH值，丁酸濃度，總揮發(fā)性脂肪酸濃度沒(méi)有影響。脂肪酸組成分析表明，

10、EPA顯著降低了瘤胃中的C15∶0、C16∶0、C17∶0及C18∶0的含量（P＜0.01）;提高了瘤胃中cis-9，trans-11，trans-9，cis-12的含量(P＜0.01)，提高trans-11 C18∶1的含量（P＜0.01）;山羊瘤胃灌注EPA提高了瘤胃中單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸的含量（P＜0.01）。對(duì)瘤胃細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)的DGGE分析結(jié)果顯示，EPA影響了山羊瘤胃細(xì)菌多樣性，與對(duì)照組相比，EPA處理組瘤胃細(xì)菌多樣

11、性顯著下降(P＜0.05)，5條優(yōu)勢(shì)條帶隨著EPA添加量的提高而逐漸消失。16S rRNA基因序列分析表明，與這5條帶相對(duì)應(yīng)的最相似菌菌為瘤胃中未可培養(yǎng)細(xì)菌。山羊瘤胃灌注EPA改變了瘤胃微生物數(shù)量，定量PCR分析表明EPA顯著降低了瘤胃細(xì)菌總量、Butyrivibrio.spp的數(shù)量和B.proteoclasticus的數(shù)量(P＜0.01)，顯著提高了瘤胃真菌數(shù)量（P＜0.01）。原蟲(chóng)計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，EPA對(duì)瘤胃原蟲(chóng)數(shù)量沒(méi)有影響。一般線性

12、回歸分析顯示C18∶3，C18∶2，C18∶1分別與Butyrivibrio數(shù)量負(fù)相關(guān)(C18∶3，P＜0.01，R2=0.70;C18∶2∶P＜0.01,R2=0.63;C18∶1∶ P＜0.01,R2=0.74);C18∶0與B.proteoclasticus的數(shù)量呈正相關(guān)(P＜0.01，R2=0.93)。結(jié)果提示，EPA通過(guò)抑制Butyrivibrio.spp的生長(zhǎng)，抑制了瘤胃不飽和脂肪酸的氫化;瘤胃中一些未可培養(yǎng)菌的細(xì)菌與瘤胃C

13、18∶0的密切相關(guān)。
　　 4. DHA和EPA對(duì)瘤胃真菌生長(zhǎng)代謝的影響
　　 通過(guò)體外試驗(yàn)研究了不同劑量(0μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL)DHA、EPA對(duì)山羊瘤胃真菌體外發(fā)酵的影響。測(cè)定了培養(yǎng)96h后，培養(yǎng)液的pH值、發(fā)酵產(chǎn)氣量和代謝產(chǎn)物濃度。結(jié)果顯示:添加DHA線性升高了發(fā)酵體系的pH值（P＜0.05），降低了發(fā)酵體系中的甲酸（P＜0.01），乙酸（P＜0.05）以及乳酸濃度（P＜0.0

14、5），降低了真菌發(fā)酵的總產(chǎn)氣量（P＜0.05）。添加20μg/mL DHA、50μg/mL DHA延滯了發(fā)酵時(shí)間。添加50μg/mL DHA對(duì)真菌生長(zhǎng)有明顯的抑制作用。添加EPA對(duì)真菌發(fā)酵體系中的發(fā)酵體系的pH值、甲酸、乙酸及乳酸濃度沒(méi)有影響，但降低了真菌發(fā)酵的總產(chǎn)氣量(P＜0.05)。10μg/mL EPA縮短了真菌發(fā)酵的延滯期，促進(jìn)了真菌發(fā)酵，而50μg/mLEPA延滯了發(fā)酵時(shí)間，有抑制真菌生長(zhǎng)的趨勢(shì)。DHA、EPA對(duì)瘤胃真菌數(shù)量沒(méi)