1、從適應(yīng)土壤定殖的溶磷微生物中篩選到一株適應(yīng)生產(chǎn)的溶磷真菌,并進行了其土壤溶磷特性和溶磷機理初步研究,選取溶磷效果較好的菌株進行了溶磷相關(guān)基因的克隆、表達和功能鑒定,取得以下主要結(jié)果:
　　 在磷酸三鈣為唯一磷源的無機鹽培養(yǎng)基上。以透明圈為指示,通過初篩和復(fù)篩,獲得效果穩(wěn)定的細菌23株,分屬6個屬11個種；真菌16株,其中有9株草酸青霉(Penicillium oxalicum),2株變幻青霉(Penicillium variab

2、ile),1株刺孢青霉(Penicillium aculeatum)、1株綠色木霉(Trichoderma viride)、2株黑曲霉(Aspergillus niger)、1株構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)。
　　 菌株對不同難溶磷(磷酸三鈣、磷酸鋅、磷酸鋁和磷酸鐵)的溶解能力實驗表明:細菌對不同種類難溶磷溶解能力差異顯著,真菌的溶磷效果顯著高于細菌,16株真菌顯著降低PDB培養(yǎng)液的pH值,最低達到1.4

3、3,固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d能將各種難溶磷全部溶解。
　　 通過16株真菌在不同土壤中的定殖能力和釋放難溶磷的效果比較,篩選土壤中定殖和溶磷效果好的菌株。土培實驗結(jié)果表明:真菌在土壤中具有較強的定殖能力；不同土壤中真菌的定殖能力差異顯著,同一種的真菌在土壤中的定殖能力也差異顯著。真菌釋放土壤難溶磷的能力與其土壤定殖的能力顯著相關(guān),菌株定殖能力越強,釋放土壤難溶磷效果越好。其中,真菌Z33、Zh、ZC、Zh3、ZI1、Z15、zQ3

4、和Z30在土壤中定殖效果較好,28 d時,菌株數(shù)量能達到起始值的10～48倍,有效磷含量增加44％～160％。
　　 通過微生物與作物、土壤的匹配性實驗,篩選適應(yīng)玉米生產(chǎn)的溶磷真菌,并開展了溶磷菌對土壤微生物多樣性影響分析。溶磷微生物與作物的匹配性實驗表明:16株真菌在平板上對玉米根系分泌物的適應(yīng)性差異顯著,Z15+、Zh、ZQ3、ZI1、ZJ1和Z30能夠利用玉米的根系分泌物快速生長,并且能溶解平板中的磷酸三鈣。選取這6株真菌

5、進行土培實驗,結(jié)果也證明Z15+、ZQ3、ZI1、Zh和Z30都能以玉米根系分泌物為營養(yǎng)進行繁殖,第21天時,菌株數(shù)量達到起始的9.70～48.03倍,土壤有效磷增加了62.08％～147.55％。在盆栽玉米的土壤中,ZI1和Zh定殖的速度最快,菌劑ZI1和Zh處理后,玉米干重和濕重顯著增加,在大田試驗中,菌株Zh連續(xù)2年都具有較高的增產(chǎn)作用,而菌株ZI1只在2010年的試驗中具有較好的增產(chǎn)作用。因此本文獲得適應(yīng)大田玉米生產(chǎn)的溶磷真菌為

6、構(gòu)巢曲霉Zh。溶磷菌劑對土壤微生物的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生顯著的影響,總體趨勢為細菌、真菌、放線菌的數(shù)量比對照有所增加,土壤中微生物多樣性變化與土壤中細菌數(shù)量變化成正相關(guān),土壤中細菌數(shù)量越多,土壤微生物多樣性越高。
　　 選取具有較好增產(chǎn)效果的構(gòu)巢曲霉Zh和草酸青霉ZI1,對其產(chǎn)酸的種類,不同溫度條件下土壤溶液pH值的變化、菌株定殖能力以及土壤中不同級別難溶磷的轉(zhuǎn)化規(guī)律進行研究,探討了溶磷真菌在土壤中溶磷機理和溶磷特性。利用離子色譜對菌株產(chǎn)酸

7、種類進行分析,結(jié)果表明:構(gòu)巢曲霉Zh和草酸青霉Z11在PDB溶液中能夠大量產(chǎn)生乳酸和草酸,培養(yǎng)26 h時,溶液中乳酸和草酸的含量分別達到了372.5μg／mL和593.9μg／mL。菌株Zh和ZI1在15、20和30℃土培條件下,都有很強的定殖能力,并能使土壤溶液的pH值顯著降低,土壤溶液pH值變化與菌株在土壤中定殖的規(guī)律一致。不同的溫度下,菌株Zh和ZI1對土壤中不同級別的難溶磷的轉(zhuǎn)化規(guī)律總體趨勢一致,土壤中Ca2-P、Ca8-P、A

8、l-P、Fe-P和Ca10-P形態(tài)的無機磷含量都發(fā)生了變化,菌株Zh轉(zhuǎn)化土壤中Ca8-P量較高,而菌株ZI1對Al-P、Fe-P轉(zhuǎn)化效率較高。菌株Zh和ZI1溶磷機理為菌株在土壤繁殖過程中分泌有機酸與鐵、鋁、鈣等離子螯合,從而使難溶磷轉(zhuǎn)化為有效磷。
　　 構(gòu)建黑曲霉Zh3和草酸青霉ZI1的cDNA文庫,在磷酸三鈣為唯一磷源的無機鹽培養(yǎng)基上以透明圈為指示,篩選溶磷克隆子,結(jié)果從菌株Zh3和ZI1的cDNA文庫中分別篩選到攜帶溶磷相

9、關(guān)基因的克隆子60個和72個,這些克隆子在第二代轉(zhuǎn)接后功能穩(wěn)定,確認這些克隆子所攜帶的基因具有溶磷的功能。黑曲霉Zh3文庫中篩選的克隆子所攜帶基因序列全長為1407bp,與Aspergillus niger CBS513.88和Aspergillus niger contig An07c0220的同源性達到98％,與其他菌的同源性低于80％,但目前還沒報到該基因在溶磷功能方面的研究,將該基因命名為pag T。草酸青霉ZI1文庫中篩選的克

10、隆子所攜帶基因序列全長為1160bp,與Penicilliumchrysogenum Wisconsin54-1255和Aspergillus niger CBS513.88的同源性只有68％,與其他菌的同源性更低,表明該基因為一個新的基因,將該基因命名為ppg T。
　　 分析溶磷相關(guān)基因ppq T和paq T的開放閱讀框,構(gòu)建重組表達載體,獲得轉(zhuǎn)化子,并分析轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生有機酸種類和溶液pH值的變化。草酸青霉ZI1中溶磷相關(guān)基因

11、ppg T開放閱讀框長702 bp,蛋白長233個氨基酸,該蛋白與Penicillium chrysogenum Wisconsin54-1255的Pc21g23580同源性最高,為59％,目前還沒有該類蛋白的功能研究報道,確定本文獲得的蛋白PPG-T為新的蛋白。黑曲霉Zh3中溶磷相關(guān)基因pag T開放閱讀框長819 bp,蛋白長333個氨基酸,該蛋白與Aspergillus niger CBS513.88的bax Inhibitor

12、family protein同源性達到100％,但該蛋白還沒有溶磷功能的報道,屬于該蛋白的新功能。將ppq T和paq T的開放閱讀框連接到pET28和pGEX表達載體中,構(gòu)建了4株轉(zhuǎn)化子,產(chǎn)生的乙酸和甲酸將難溶磷無機鹽培養(yǎng)液的pH值降低到3.6左右,在LB培養(yǎng)中,4株轉(zhuǎn)化子不能將溶液的pH值降低,表明基因的表達需要難溶磷的誘導(dǎo)。ppq T基因在E.coli.DH5α中的溶磷機理是將葡萄糖氧化生成乙酸,溶解無機磷；而paq T基因在E.