1、大豆疫霉(Phytophthora sojae)是一種重要的植物病原菌，所引起的大豆根腐病，每年給世界各大豆主產(chǎn)區(qū)造成高達(dá)數(shù)百億美元的經(jīng)濟損失。所以有效地控制大豆疫霉病的發(fā)生和擴展成為研究者的主要任務(wù)。然而，由于疫霉菌隸屬于茸鞭生物界卵菌門，在進化上與真菌相差很遠(yuǎn)，進化上的差異也使疫霉菌擁有一套與其他真菌不同的致病機制，多數(shù)殺菌劑對植物疫病無效。疫霉菌遺傳轉(zhuǎn)化困難，對疫霉菌與植物互作機理的研究進展緩慢。近年，隨著大豆疫霉全基因組測序的完

2、成和遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的逐步建立，大豆疫霉菌已經(jīng)成為研究卵菌分子遺傳的模式種，同時也為從基因水平上理解疫霉菌致病分子機制提供了一個新的平臺。本研究充分發(fā)揮生物信息學(xué)技術(shù)優(yōu)勢，通過對致病相關(guān)MAP kinase PsSAK1沉默突變體DGE表達(dá)譜進行分析，迅速篩選到一批受PsSAK1調(diào)控的候選基因，結(jié)合大豆疫霉的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化和生物學(xué)研究手段，確定了PsMYB1轉(zhuǎn)錄因子的功能以及和PsSAK1的關(guān)系，為進一步認(rèn)識大豆疫病的分子致病機理和開發(fā)該病害的防

3、治措施提供了理論和實踐意義。
　　 研究大豆疫霉的生長發(fā)育及致病過程中的相關(guān)基因?qū)忉尣『Πl(fā)生流行和病害控制有重要理論與實踐價值。在前期工作中，我們借助PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法，確定了2個MAPKs在大豆疫霉生長發(fā)育及致病過程中的重要作用。我們試圖進一步探求其作用機制，而研究MAPK途徑的關(guān)鍵是找到它的下游調(diào)控基因。因此，我們利用DGE表達(dá)譜分析技術(shù)對大豆疫霉PsSAK1、PsMPK1沉默突變體不同階段進行轉(zhuǎn)錄組分析，結(jié)果發(fā)

4、現(xiàn)，應(yīng)答外界刺激的MAPK PsSAK1的沉默，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子、蛋白激酶、結(jié)構(gòu)蛋白以及致病相關(guān)因子編碼基因表達(dá)水平發(fā)生顯著變化。其中轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄水平變化明顯。另外，負(fù)責(zé)調(diào)控細(xì)胞壁完整性途徑的PsMPK1的功能缺失，導(dǎo)致細(xì)胞壁相關(guān)蛋白編碼基因、PsNLP1的基因表達(dá)水平顯著變化。結(jié)合我們的表型結(jié)果顯示突變體的游動孢子在與寄主植物互作過程中，誘導(dǎo)寄主細(xì)胞死亡，阻止病原菌的擴展，我們推測，PsMPK1的功能缺失，造成細(xì)胞壁受損，導(dǎo)致在與寄主互

5、作過程中重要致病因子外漏，誘導(dǎo)寄主壞死反應(yīng)，是沉默突變體致病力喪失的重要成因。
　　 在PsSAK1沉默突變體DGE表達(dá)譜顯著下調(diào)的轉(zhuǎn)錄因子編碼基因中，我們鑒定了一個R2R3型MYB轉(zhuǎn)錄因子編碼基因-PsMYB1，該基因全長1542bp，含有3個內(nèi)含子，其編碼的蛋白含513個氨基酸。qRT-PCR的結(jié)果顯示PsMYB1的轉(zhuǎn)錄水平在孢子囊形成階段，休止孢萌發(fā)，以及侵染早期上調(diào)表達(dá)，而在游動孢子階段幾乎消失。PsMYB1的沉默突變體

6、菌絲生長速率以及有性生殖無差別;然而，在孢子囊的發(fā)育，游動孢子的正常形成以及成功釋放，侵染寄主大豆等方面表現(xiàn)出嚴(yán)重的功能缺失。該基因的沉默導(dǎo)致＞50％的孢子囊不能正常釋放游動孢子，轉(zhuǎn)而直接萌發(fā)，這直接造成游動孢子的產(chǎn)量極顯著的下降。而且，游動孢子表現(xiàn)出休止提前，萌發(fā)率降低，接種大豆黃化苗下胚軸后致病力下降。究其原因，我們發(fā)現(xiàn)，PsMYB1的功能缺失導(dǎo)致部分孢子囊內(nèi)原生質(zhì)體不能正常割裂，細(xì)胞核排布異常。結(jié)合PsSAK1的沉默突變體在以上各

7、個階段的表現(xiàn)型，闡明了受PsSAK1調(diào)控的PsMYB1負(fù)責(zé)調(diào)控大豆疫霉包括孢子囊細(xì)胞質(zhì)的割裂，細(xì)胞核的排布，以及游動孢子釋放及萌發(fā)等一系列致病相關(guān)生物學(xué)過程。
　　 對已克隆的PsMYB1的同源物的研究發(fā)現(xiàn)大豆疫霉可能具有龐大的MYB基因家族。通過對大豆疫霉基因組數(shù)據(jù)庫、真菌轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫(FTFD)，蛋白功能域結(jié)構(gòu)分析軟件(SMART)的生物信息學(xué)注釋，結(jié)合手動修正基因模型，我們預(yù)測到大豆疫霉中含有68個MYB轉(zhuǎn)錄因子。其中包

8、含47個R1型(PsMYB-like1-1～PsMYB-like1-47)，9個R2R3型(PsMYB-like2-1～ PsMYB-like2-9)，10個R1R2R3型(PsMYB-like3-1～PsMYB-like3-10)，還有2個蛋白分別含有4或5個Myb功能域(PsMYB-like4-1，PsMYB-like5-1)。利用DGE表達(dá)譜分析技術(shù)對這68個MYB基因在大豆疫霉菌5個不同無性發(fā)育階段及5個侵染階段的高通量表達(dá)分析

9、，發(fā)現(xiàn)所有基因的表達(dá)量至少在一個階段能被檢測到。同時，我們對相同轉(zhuǎn)錄模式的基因進行歸類，共分為7類。并結(jié)合68個Myb家族候選成員在兩個MAPKs的沉默突變體，三個DGE表達(dá)譜中的各自差異表達(dá)水平，分析其在大豆疫霉致病相關(guān)生物學(xué)過程中扮演的角色。
　　 鑒于PsMYB1在大豆疫霉菌生長發(fā)育以及致病相關(guān)生物學(xué)過程中的重要作用，我們假設(shè)MYB基因家族中的其他同族基因在致病過程中同樣扮演重要角色。為了驗證這一假說，我們結(jié)合大豆疫霉5個

10、無性發(fā)育階段和5個侵染階段的轉(zhuǎn)錄量分析，沉默突變體的DGE表達(dá)譜分析，以及雙鏈RNA(dsRNA)介導(dǎo)的基因沉默對MYB家族候選基因進行高通量篩選。我們鑒定了在侵染階段上調(diào)表達(dá)的4個基因分別是:PsMYB-like2-2(Ps127211), PsMYB-like1-7(Ps131312), PsMYB-like1-39(Ps141522),PsMYB-like3-6(Ps133941)。而在三個突變體不同階段的DGE轉(zhuǎn)錄譜中，4個基因

11、均表現(xiàn)出在某一階段由于MAPK的沉默導(dǎo)致發(fā)生顯著的基因水平的變化。其中，我們發(fā)現(xiàn)了一個R1型Myb轉(zhuǎn)錄因子PsMYB-like1-39(Ps141522)，與游動孢子的釋放過程密切相關(guān)，但不影響大豆疫霉的致病力。
　　 本文從致病相關(guān)MAPK PsSAK1的功能缺失突變體轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)入手，尋找由于該基因的沉默而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄量下降的候選基因，從中成功鑒定了PsMYB1轉(zhuǎn)錄因子在大豆疫霉致病相關(guān)發(fā)育階段的作用。根據(jù)這一重要線索，結(jié)合生物信