1、精子超活化運(yùn)動(dòng)是精子獲能和發(fā)生頂體反應(yīng)的一個(gè)重要生理前提，其賦予精子強(qiáng)有力運(yùn)動(dòng)，使其逃離輸卵管上皮“誘捕”，成功穿越透明帶與卵子結(jié)合完成受精。先前的研究包括本課題組已經(jīng)證實(shí)，在眾多質(zhì)膜離子通道中，Cation channel of sperm(CaSper)蛋白家族所介導(dǎo)的Ca2+直接參與精子超活化的調(diào)控過(guò)程。作為介導(dǎo)Ca2+專一性通道蛋白，CatSper蛋白家族與精子超活化和受精力直接相關(guān)[62,63]，且其專一性表達(dá)于睪丸和成熟的精

2、子。過(guò)去的幾年中，對(duì)于對(duì)CatSper家族的研究主要是集中于對(duì)其功能的探討，尚未見(jiàn)以其為靶點(diǎn)進(jìn)行雄性生殖調(diào)控的研究，可以預(yù)見(jiàn)在現(xiàn)有對(duì)CatSper家族蛋白研究基礎(chǔ)上，抑制或敲減CatSper家族蛋白某個(gè)亞基的表達(dá)，探討雄性生殖調(diào)控的最佳靶點(diǎn)將成為未來(lái)CatSper家族蛋白研究的重點(diǎn)，
　　 本研究針對(duì)大鼠CatSper蛋白家族的一個(gè)亞基CatSper2構(gòu)建質(zhì)粒載體和病毒載體，借助睪丸網(wǎng)微注射和活體電轉(zhuǎn)等措施轉(zhuǎn)染大鼠睪丸，以期通過(guò)

3、阻斷大鼠精子胞外Ca2+峰，抑制精子超活化過(guò)程，而實(shí)現(xiàn)對(duì)雄性生殖調(diào)控的目的。研究中，分別利用小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)、熒光解剖鏡、FCM、CASA、Q-PCR、Westem-blot、激光共聚焦顯微鏡、IVF和組織學(xué)分析等手段，對(duì)活體干涉后大鼠睪丸組織和附睪精子的轉(zhuǎn)染效率、精子超活化運(yùn)動(dòng)、CatSper2表達(dá)敲減率、精子胞內(nèi)Ca2+震蕩波、精子受精能力、體外存活時(shí)間，以及睪丸網(wǎng)微注射和活體電轉(zhuǎn)等可能對(duì)睪丸功能和精子生理機(jī)能產(chǎn)生的影響等問(wèn)題分別

4、進(jìn)行了系統(tǒng)分析。
　　 主要研究結(jié)果如下:
　　 1.成功構(gòu)建了大鼠CatSper2基因的質(zhì)粒載體和病毒載體，并在大鼠活體睪丸實(shí)現(xiàn)了高效轉(zhuǎn)染和表達(dá);
　　 根據(jù)體外電穿孔介導(dǎo)siRNA轉(zhuǎn)染精子篩選出的最佳干涉序列，實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了CatSper2基因質(zhì)粒載體和病毒載體，并借助睪丸網(wǎng)微注射和活體電轉(zhuǎn)的手段在大鼠活體獲得了良好轉(zhuǎn)染和高效表達(dá)效果。相比于病毒載體的持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)，質(zhì)粒載體結(jié)合活體電轉(zhuǎn)的方法在對(duì)CatSper

5、2基因的敲減方面更加有優(yōu)勢(shì)。反過(guò)來(lái)，就轉(zhuǎn)染后大鼠附睪陽(yáng)性精子率來(lái)講，盡管質(zhì)粒載體組87.75％略高于病毒組的83.3％（P＞0.05），但在轉(zhuǎn)染后第60d獲得附睪陽(yáng)性精子率，病毒組的78.7％略高于質(zhì)粒組的77.75％(P＞0.05)，并且在兩者對(duì)CatSper2蛋白的敲減持續(xù)性方面，病毒組同樣優(yōu)于質(zhì)粒組。這表明病毒重組質(zhì)粒能夠?qū)λ拗骷?xì)胞獲得更好的整合性。但是兩者之間的這些數(shù)據(jù)之間并不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 2、生理狀態(tài)下，質(zhì)粒

6、載體和病毒載體對(duì)睪丸的轉(zhuǎn)染和表達(dá)效率存在強(qiáng)的濃度和時(shí)間依賴性;
　　 通過(guò)小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)和熒光解剖鏡的分析可以知道，隨著質(zhì)粒載體（25μg～50μg）和病毒載體（10μl～40μl）注射劑量的增大，睪丸表面所捕獲的GFP熒光信號(hào)及觀察到熒光表達(dá)逐漸增強(qiáng)，呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性，注射50μg質(zhì)粒載體和40μl病毒液時(shí)獲得了最強(qiáng)的GFP表達(dá)信號(hào)。但在對(duì)數(shù)據(jù)分析后表明，對(duì)于質(zhì)粒載體注射45μg和50μg睪丸GFP信號(hào)強(qiáng)度并沒(méi)有顯著差

7、異(P＞0.05);在病毒轉(zhuǎn)染組注射35μl和40μl病毒液時(shí)兩者睪丸GFP表達(dá)也沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，為了獲得更好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中均以注射45μg質(zhì)粒載體和35μl病毒載體進(jìn)行相關(guān)的研究;從實(shí)驗(yàn)的結(jié)果知道，當(dāng)注射同等劑量的質(zhì)粒載體和病毒液時(shí)，兩者轉(zhuǎn)染效率同樣存在顯著的時(shí)間依賴性，質(zhì)粒載體和病毒載體對(duì)睪九組織和附睪精子CatSper2表達(dá)敲減的峰值均出現(xiàn)在了轉(zhuǎn)染后第13天和第22天。
　　 3、活體干涉后大鼠附睪精子CASA分

8、析顯示，精子胞內(nèi)儲(chǔ)存Ca2+足夠起始超活化過(guò)程，但沒(méi)有胞外峰的支持，超活化過(guò)程將無(wú)法維持;
　　 當(dāng)應(yīng)用50μM thimerosal處理大鼠的精子時(shí)，無(wú)論胞外環(huán)境中是否存在Ca2+，90％以上的處理組和對(duì)照組精子都能夠發(fā)生超活化過(guò)程，只不過(guò)這一過(guò)程非常短暫;之后如果將精子在含有5 mM procaine獲能液中孵育5 min，相比于對(duì)照組90％以上的精子再次獲得超活化不同，干涉處理組精子卻因?yàn)橘|(zhì)膜上沒(méi)有更多的CatSper2通

9、道蛋白響應(yīng)procaine的激活，無(wú)法介導(dǎo)更多的Ca2+峰的進(jìn)入胞質(zhì)，精子細(xì)胞內(nèi)持續(xù)處于較低Ca2+濃度的狀態(tài)，這表明盡管細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存Ca2+足夠起始超活化過(guò)程，但如果沒(méi)有胞外Ca2+峰的有效補(bǔ)充超活化過(guò)程將無(wú)法得以維持。
　　 4、CatSper2表達(dá)敲減后，精子胞內(nèi)Ca2+峰的缺失，使精子喪失穿越透明帶的能力無(wú)法完成受精;
　　 體外受精實(shí)驗(yàn)證實(shí)，干涉處理組大鼠附睪精子由于缺少一種穿越透明帶的“力量”而不能像對(duì)照組一樣

10、使正常卵子受精。相反，以0.4％透明質(zhì)酸酶將透明帶去除后的卵子卻能與干涉處理組精子正常受精，并且受精率并沒(méi)有顯著差異;為了更進(jìn)一步揭示干涉處理組精子無(wú)法使正常卵母細(xì)胞受精的真正原因，我們又進(jìn)行粘滯性溶液中精子遷移率的實(shí)驗(yàn)，相對(duì)于對(duì)照組和Mock組精子前進(jìn)行性運(yùn)動(dòng)下降為正常狀態(tài)的48％，病毒轉(zhuǎn)染處理組精子前進(jìn)行性幾乎完全被抑制。這也進(jìn)一步表明阻礙干涉處理組精子無(wú)法完成受精的主要原因是，透明帶粘滯性環(huán)境對(duì)喪失超活化運(yùn)動(dòng)的大鼠精子是最大的障礙

11、。
　　 5、睪丸組織學(xué)和精子體外存活研究證實(shí)，睪丸網(wǎng)微注射和活體電轉(zhuǎn)的處理并沒(méi)有大鼠睪丸功能和精子本身產(chǎn)生有害影響。
　　 睪丸微注射結(jié)合活體電轉(zhuǎn)介導(dǎo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染睪丸，通過(guò)敲減CatSper2基因表達(dá)探索雄性生殖調(diào)控的最佳靶點(diǎn)，最重要的是要保證睪丸功能和精子的產(chǎn)生及其功能沒(méi)有受到影響。為了證實(shí)這些方法可能的副作用，我們對(duì)睪丸網(wǎng)微注射和活體電轉(zhuǎn)后大鼠的睪丸組織和精子體外存活率等指標(biāo)進(jìn)行了分析，從圖4-6結(jié)果知道，隨著轉(zhuǎn)染時(shí)間

12、的延長(zhǎng)，可以看到不同生長(zhǎng)階段的曲細(xì)精管上皮細(xì)胞表達(dá)GFP，這表明注射和電轉(zhuǎn)后，大鼠的精子發(fā)生周期是正常的，并且顯微鏡下并沒(méi)有見(jiàn)到明顯的組織損傷和出血點(diǎn)。而精子體外存活能力實(shí)驗(yàn)也證實(shí)（圖4-5），與對(duì)照組精子相比，處理組精子體外存活能力并沒(méi)有受到影響。
　　 CatSper蛋白家族在精子超活化和受精能力方面具有重要的作用，其中任何一個(gè)亞基的異常表達(dá)不僅導(dǎo)致精子無(wú)法獲得超活化，而且失去穿越透明帶的能力。在這個(gè)研究中，睪丸網(wǎng)微注射結(jié)合