1、果實(shí)脫落是影響柑橘產(chǎn)量的重要因素之一。乙烯調(diào)節(jié)脫落過(guò)程中細(xì)胞分裂、伸長(zhǎng)、細(xì)胞壁水解等多種細(xì)胞學(xué)、生物化學(xué)進(jìn)程，是主要的脫落激素。乙烯生物合成途徑已經(jīng)闡明。研究指出，柑橘葉片和果實(shí)中都存在兩種乙烯生成系統(tǒng)，柑橘葉片在采摘后(老葉3-5天、新葉6-7天)乙烯合成表現(xiàn)為系統(tǒng)Ⅰ，老葉采后5天、新葉采后7天則表現(xiàn)出乙烯自動(dòng)催化等典型的類似躍變型果實(shí)的乙烯生成系統(tǒng)Ⅱ的特征；柑橘作為一種非躍變型的果實(shí)，成熟果實(shí)中只有系統(tǒng)Ⅰ存在，外源乙烯能促進(jìn)成熟相關(guān)

2、的色素變化加快呼吸進(jìn)程；但在幼果中表現(xiàn)出乙烯生成系統(tǒng)Ⅱ類似的特征。為探尋乙烯在柑橘成熟果實(shí)脫落過(guò)程中的作用機(jī)理，本研究進(jìn)行了乙烯誘導(dǎo)下柑橘果實(shí)離層的表達(dá)譜分析，柑橘PRP、ERF和半胱氨酸蛋白酶基因全長(zhǎng)cDNA克隆、表達(dá)分析和柑橘PRP、ERF、半胱氨酸蛋白酶基因RNAi載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化等研究。
　　 1.乙烯誘導(dǎo)下柑橘果實(shí)離層的表達(dá)譜分析
　　 利用Citrus Genome Array研究了在外源乙烯(20μL/L)

3、誘導(dǎo)下柑橘果實(shí)離層的基因表達(dá)譜，在30395個(gè)達(dá)到探針對(duì)閥值(8對(duì))要求的探針組中，檢測(cè)到20639探針組對(duì)應(yīng)的基因表達(dá)。應(yīng)用GCOS軟件系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)管理、RMA進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理、隨機(jī)方差模型的單因素方差分析法分析實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組間的差異基因之后，發(fā)現(xiàn)在FDR(false-discovery rate)≤0.02水平上乙烯處理4h、24h后分別有569和356條基因表達(dá)量的變化倍數(shù)≥4。其中，4h乙烯處理后表達(dá)量上調(diào)的有243條，處理24h

4、后上調(diào)表達(dá)的有176條；而對(duì)應(yīng)時(shí)間內(nèi)表達(dá)量下調(diào)的則分別有326條和190條。分析了隨機(jī)挑選的16條基因，所得結(jié)果與芯片數(shù)據(jù)高度一致。根據(jù)基因功能分類，發(fā)現(xiàn)這些乙烯應(yīng)答基因涉及協(xié)迫應(yīng)答、生物或非生物刺激、蛋白質(zhì)代謝、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄等多種生物學(xué)過(guò)程。經(jīng)過(guò)基因本體(Gene Ontology,GO)分析，差異表達(dá)基因中，發(fā)現(xiàn)富含羥脯氨酸蛋白-4(PRP4，proline-fich protein4)基因、乙烯響應(yīng)因子1(ERF1，e

5、thylene response factor1)基因和半胱氨酸蛋白酶(CysP,cysteine proteinase)基因高度受到乙烯調(diào)控，它們?cè)诟涕俟麑?shí)脫落中所起的作用值得關(guān)注，因而被挑選出來(lái)進(jìn)一步分析。
　　 2.柑橘CsPRP4、CsERF1、CsUnknow和CsCysP基因全長(zhǎng)cDNA克隆和表達(dá)分析
　　 根據(jù)HarvEst Citrus(Version1.25)數(shù)據(jù)庫(kù)提供的CsPRP4、CsERF1、Cs

6、Unknow和CsCysP序列信息設(shè)計(jì)了PCR引物，采用RT-PCR和SMART RACE技術(shù)和克隆操作，獲得了這些基因的全長(zhǎng)cDNA序列。
　　 序列分析結(jié)果顯示，這4個(gè)基因的全長(zhǎng)cDNA長(zhǎng)度分別是1251bp、1453bp、1545bp和1452bp，開放閱讀框(ORF)的長(zhǎng)度分別是585bp、810bp、1101bp和1050bp，分別編碼194、269、365和347個(gè)氨基酸，相應(yīng)的推測(cè)分子量分別是20.79KD、29.

7、25KD、41.6KD和38.4KD。蛋白理化性質(zhì)分析表明CsPRP4和CsERF1性質(zhì)穩(wěn)定，而CsUnknow和CsCysP不穩(wěn)定。
　　 生物信息學(xué)和基因差異表達(dá)分析表明：CsPRP4是受外源乙烯誘導(dǎo)表達(dá)量上升最強(qiáng)烈的編碼細(xì)胞壁蛋白的基因，在葉片和果實(shí)離層均表達(dá)，受乙烯誘導(dǎo)后的葉片和果實(shí)離層表達(dá)存在差異；CsERF1是AP2超基因家族成員，具轉(zhuǎn)錄因子活性，在乙烯誘導(dǎo)下表達(dá)量大量增加，CsERF作為乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的中間組分，

8、具有結(jié)合GCC-box的活性，通過(guò)與乙烯應(yīng)答基因啟動(dòng)子中的GCC-box結(jié)合調(diào)控下游基因表達(dá)，可能是最終導(dǎo)致脫落的關(guān)鍵因子之一；CsUnknow基因，定位于內(nèi)膜系統(tǒng)，具有GCC-box結(jié)合域，受乙烯強(qiáng)烈誘導(dǎo)，功能未知；CsCysP蛋白，是重要的水解蛋白酶之一，具有肽鏈內(nèi)切酶活性，是一種跨膜蛋白，定位于液泡膜上。外源乙烯作用下，CsCysP在柑橘果實(shí)離層中受到強(qiáng)烈抑制，推測(cè)其負(fù)調(diào)控下游的脫落相關(guān)基因，受其作用的某些蛋白質(zhì)的積累可能是脫落過(guò)

9、程所必須的。
　　 3.柑橘CsPRP4、CsERF1和CsCysP基因RNAi載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化
　　 采用RT-PCR方法擴(kuò)增柑橘目的基因PRP4、ERF1和CysP的cDNA片段，連接到TA克隆載體。雙元載體pFGC5941和目的基因的克隆經(jīng)限制性內(nèi)切酶兩次雙酶切，將目的基因片段按正、反向插入到pFGC5941查耳酮合成酶內(nèi)含子的兩端，構(gòu)成反向重復(fù)序列，即RNA干涉載體。通過(guò)菌液PCR、酶切檢驗(yàn)或測(cè)序等證實(shí)正、反向基

10、因片段均已正確插入到載體中。研究中保留了采用該法構(gòu)建的全長(zhǎng)正向片段與pFGC5941相連接后得到的產(chǎn)物，以用于基因的過(guò)量表達(dá)研究。采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因法得到了大量抗性芽，其中部分已經(jīng)嫁接成活，為下一步研究在干擾和過(guò)量表達(dá)這些基因后的表型打下了基礎(chǔ)。
　　 4.主要結(jié)論
　　 本實(shí)驗(yàn)在轉(zhuǎn)錄水平上大規(guī)模地研究了外源乙烯誘導(dǎo)下柑橘果實(shí)離層的基因表達(dá)譜的變化，獲得了大量潛在的參與脫落進(jìn)程的基因及其表達(dá)數(shù)據(jù)。在全面綜合分析這

11、些數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，基本明確了參與脫落過(guò)程的生理生化過(guò)程，加深了對(duì)乙烯在誘導(dǎo)柑橘果實(shí)脫落過(guò)程中基因調(diào)節(jié)等分子機(jī)理的認(rèn)識(shí)。
　　 克隆獲得了4條在柑橘果實(shí)脫落過(guò)程中受到強(qiáng)烈調(diào)控的基因CsPRP4、CsERF1、CsUnknow和CsCysP的全長(zhǎng)cDNA。對(duì)這些基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，結(jié)合表達(dá)分析，推測(cè)了其在脫落過(guò)程中可能的作用。
　　 構(gòu)建了CsPRP4、CsERF1、CsUnknow和CsCysP基因的過(guò)量表達(dá)載體和RN