1、1目的與意義
　　 當(dāng)生物體受到外界病原體侵襲時，生物機體自身會啟動主動防御來抵抗侵襲。中性粒細(xì)胞是機體主動防御系統(tǒng)中重要組成部分，具有多種抗微生物活性蛋白和肽類，其中就包括殺菌/通透性增加蛋白(Bactericidal/Permeability-increasing Protein, BPI)和防御素(Defensins)。在對奶牛乳房炎疾病的研究發(fā)現(xiàn)，一些β-防御基因在奶牛感染乳房炎時可在乳腺中誘導(dǎo)表達(dá)，說明在患乳房炎時β-

2、防御素可能在乳腺局部防御中發(fā)揮作用。同時，防御素具有抑制革蘭氏陰性菌(Gram-negative bacteria, G')和革蘭氏陽性菌(Gram-positive bacteria, G+)的活性，其對奶牛乳房炎主要致病菌金黃色葡萄球菌(Staphylococcus Aureus)及大腸桿菌(Escherichia Coli)均有抑制作用。因此其有可能是作為奶?？谷榉垦椎暮蜻x基因，在預(yù)防和防治乳房炎方面具有重要的意義。此外，在奶牛的

3、養(yǎng)殖過程中，內(nèi)毒素引起的病發(fā)癥至今仍沒有很有效的治療手段，而BPI有可能在治療內(nèi)毒素病發(fā)癥上發(fā)揮作用。同時，BPI具有特異的抗G-能力，恰好彌補了防御素在抗G-能力上的不足，且BPI和防御素對細(xì)菌均不易產(chǎn)生耐藥性。鑒于此本試驗擬采用基因工程技術(shù)，通過構(gòu)建BPI和防御素融合蛋白，以達(dá)整合它們生物活性的目的，使之抗菌譜更廣、抗菌能力更強，并以期其能用于更多疾病的治療。除此之外，融合蛋白的構(gòu)建也正好可以解決小分子多肽或蛋白因半衰期較短而容易降

4、解的問題，還可增加基因產(chǎn)物。因此，構(gòu)建BPI和防御素融合表達(dá)載體并表達(dá)其融合蛋白是十分有意義和價值的。
　　 2方法與結(jié)果
　　 (1)本試驗以具有臨床乳房炎癥狀的荷斯坦奶牛為試驗材料，提取血液白細(xì)胞總RNA。根據(jù)GenBank中牛BPI基因序列(序列號：BC102310.1, GI:74354930)，設(shè)計引物，并在引物的5'端引入EcoRⅠ和SalⅠ酶切位點。采用RT-PCR技術(shù)，巢式PCR的方法擴增出BPI基因N-

5、端的cDNA序列，片段大小為714bp。構(gòu)建pEASY-T1-BPI質(zhì)粒，克隆測序。BLAST比對結(jié)果顯示：核酸序列同源性達(dá)99％,氨基酸序列同源性達(dá)100％。根據(jù)GenB ank中牛BNBD4基因序列(序列號：NM_174775.1, GI:28849940)，設(shè)計引物，并在引物的5’端引入HindⅢ和XhoⅠ酶切位點。采用RT-PCR技術(shù)擴增出BNBD4基因的cDNA序列，片段大小為192bp。構(gòu)建pBluescript-BNBD4

6、質(zhì)粒，克隆測序。BLAST比對結(jié)果顯示：核酸序列同源性達(dá)100％。
　　 (2)首先線性化(EcoRⅠ和SalⅠ)空載的pET-28a(+)質(zhì)粒，將BPI基因與其連接，構(gòu)建pET-BPI質(zhì)粒。然后再線性化(HindⅢ和Xho I)pET-BPI質(zhì)粒，將BNBD4基因與其連接，構(gòu)建出pET-BPI-BNBD4融合表達(dá)質(zhì)粒。
　　 (3)對含有重組pET-BPI-BNBD4質(zhì)粒的工程菌進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE顯

7、示37℃下IPTG濃度為1.0mmol/L時，誘導(dǎo)4h時蛋白表達(dá)量最高，且上清和包涵體中均有大小約為37.3kDa的融合蛋白出現(xiàn)，其大小與生物信息軟件ProtParam分析一致。Western blot鑒定結(jié)果顯示在相應(yīng)的位置同樣出現(xiàn)清晰的蛋白條帶。
　　 (4)融合蛋白體外抑菌試驗：瓊脂孔擴散法和酶標(biāo)儀檢測均表明，融合蛋白對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均表現(xiàn)出抑制作用。
　　 3結(jié)論
　　 本試驗成功克隆了牛BPI