1、本文主要根據(jù)GenBank已公布的兔防御素NP-1基因和豬防御素pBD-1基因序列，分別選用原核或真核高效表達(dá)載體構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，以期在大腸桿菌或COS-7細(xì)胞中得到高效表達(dá)，為進(jìn)一步研究這兩個(gè)抗菌肽奠定基礎(chǔ)。本文主要根據(jù)GenBank已公布的兔防御素NP-1基因和豬防御素pBD-1基因序列，分別選用原核或真核高效表達(dá)載體構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，以期在大腸桿菌或COS-7細(xì)胞中得到高效表達(dá)，為進(jìn)一步研究這兩個(gè)抗菌肽奠定基礎(chǔ)。 在實(shí)驗(yàn)

2、一中，根據(jù)兔防御素NP-1基因序列，選用大腸桿菌偏愛的密碼子，應(yīng)用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)，去除基因原有的影響其在大腸桿菌中高效表達(dá)的成分，對(duì)原有的NP-1基因序列進(jìn)行改造，經(jīng)改造后的NP-1基因其編碼的氨基酸多肽鏈一級(jí)結(jié)構(gòu)保持不變。采用PCR技術(shù)將兩個(gè)片段延伸成一條完整的NP-1基因鏈。將該基因擴(kuò)增得到的帶酶切位點(diǎn)的產(chǎn)物克隆到pGEM-T easy Vector上，經(jīng)酶切鑒定和序列分析正確后，再經(jīng)雙酶切連接到用同樣酶切的載體pMAL-p2X上，

3、并將得到的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli TB1，以濃度為0.1mM的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。 在實(shí)驗(yàn)二中，根據(jù)豬防御素pBD-1基因序列，應(yīng)用計(jì)算機(jī)軟件設(shè)計(jì)出一對(duì)帶有酶切位點(diǎn)Hind Ⅲ，Xba Ⅰ的引物。從新鮮的豬舌表皮組織細(xì)胞中分離提取總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)擴(kuò)增出豬防御素pBD-1基因的第一鏈cDNA，將回收的第一鏈cDNA產(chǎn)物用上述特異引物再次擴(kuò)增、回收，得到約213bp的目的片段，用T4DNA連接酶將