1、多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(Polygalacturonase inhibiting proteins，PGIPs)是一種胞外的細(xì)胞壁結(jié)合糖蛋白，在植物的防衛(wèi)反應(yīng)中具有重要的作用。它能夠特異性結(jié)合病原真菌分泌的內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶并抑制其水解活性，限制植物致病真菌的生長(zhǎng)，同時(shí)引發(fā)植物的防衛(wèi)反應(yīng)。它還與大多數(shù)植物抗性基因一樣，屬于富亮氨酸重復(fù)(Leucine-rich repeat，LRR)蛋白超家族。pgip基因在植物抗病育種中已成為一重

2、要的候選基因，其分離鑒定是進(jìn)行轉(zhuǎn)基因研究的基礎(chǔ)。 根據(jù)李屬pgip基因序列保守區(qū)域設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物，以桃(Prunuspersica(L.)：Batch)葉片制備的總RNA為模板，采用反轉(zhuǎn)錄.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Reverse transcription-polymerasechain reaction，RT-PCR.)技術(shù)，克隆到了約1，000 bp的cDNA片段。該片段與pMD 18-T載體連接后轉(zhuǎn)化Escherichia co

3、li JMl09，對(duì)篩選到的陽(yáng)性克隆進(jìn)行序列測(cè)定與分析結(jié)果表明，獲得的cDNA長(zhǎng)1，053 bp，是桃的pgip基因，命名為PPPgip，GenBank登錄號(hào)為EF409977。該片段含完整的開放閱讀框990 bp，編碼330個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，具有7個(gè)潛在的N.糖基化位點(diǎn)。預(yù)測(cè)該蛋白質(zhì)分子量為36.4 kDa，等電點(diǎn)為7.42，N端24個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的疏水區(qū)域?yàn)樾盘?hào)肽。序列同源比對(duì)結(jié)果顯示，所克隆的Pppgip基因與李屬其它p

4、gip基因核苷酸序列的同源性為93.2～94.6％，推導(dǎo)氨基酸序列的同源性為89.7～92.7％；同源樹表明其明顯區(qū)別于其它pgip基因；進(jìn)一步的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，所克隆的PPPgip基因與馬哈利櫻桃(P.mahaleb L.)的pgip基因關(guān)系較近，而與壽星桃(P. persica L.vat.densa Makino)、桃栽培品種‘久?！?P.persica(L.)Batch)等pgip基因都存在較遠(yuǎn)的進(jìn)化關(guān)系。采用SyPred3

5、D軟件預(yù)測(cè)了該基因所編碼的蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，表明PpPGIP的三維模型類似馬蹄形的結(jié)構(gòu)，含11段α-螺旋和21段p.折疊，具有8個(gè)β-折疊/β-轉(zhuǎn)角/β-折疊/α-螺旋區(qū)，中心LRR結(jié)構(gòu)域由lO個(gè)串聯(lián)的LRRs基序組成。 將該基因成熟肽編碼區(qū)序列克隆到pET-32a(+)表達(dá)載體中，分別構(gòu)建了融合表達(dá)質(zhì)粒(pET-FPGIP)和非融合表達(dá)質(zhì)粒(pET-PGIP)，在E coli：Rosetta-gami(DE3)pLysS中通過