1、金絲桃素是貫葉連翹中具有抗腫瘤和抗病毒活性的一種含量較低的萘駢二蒽酮類化合物，目前所采用的提取方法存在很多不足，致使該化合物的提取率較低。本研究采用經(jīng)電子束和重離子束輻照誘變的黑曲霉和綠色木霉所分泌的纖維素酶作為植物細(xì)胞壁裂解劑，通過優(yōu)化酶解條件提高該化合物的提取率，減少貫葉連翹資源的浪費(fèi)。同時應(yīng)用微波輔助合成的方法對金絲桃素的化學(xué)合成路線進(jìn)行了優(yōu)化，提高了反應(yīng)的收率，降低了副產(chǎn)物的生成量。主要研究內(nèi)容如下：
　　 (1)對黑曲

2、霉GSICC60108和綠色木霉GSICC62010的產(chǎn)酶條件進(jìn)行了優(yōu)化，所得黑曲霉的最佳發(fā)酵工藝為：培養(yǎng)時間72 h，接種量8.0％，培養(yǎng)溫度28℃，初始pH值4.5，表面活性劑Tween-80的添加量為1.0％，最佳的碳源為稻草粉，最佳的氮源是以1:5的比例進(jìn)行配比的硫酸銨和麩皮的混合物。綠色木霉的最佳培養(yǎng)溫度35℃，初始pH值5.0，其余條件同黑曲霉。
　　 (2)建立了產(chǎn)纖維素酶菌株的高通量篩選方法，采用剛果紅-纖維素平

3、板初篩和新建立的高通量微孔板法復(fù)篩進(jìn)行突變體的篩選。所建復(fù)篩方法的回歸方程為Y=0.208X+0.0006，標(biāo)準(zhǔn)曲線在0 mg/mL-10 mg/mL的濃度范圍內(nèi)線性較好，線性相關(guān)系數(shù)為0.99975。其精密度、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性均能夠滿足高通量篩選的要求。與國際通用的濾紙酶活力測定方法相比，測定結(jié)果無顯著差異。
　　 (3)以黑曲霉GSICC60108和綠色木霉GSICC62010為初始菌株，對其單孢子懸液進(jìn)行電子束輻照。黑曲霉和

4、綠色木霉孢子的致死劑量分別為1000 Gy和750 Gy，且分別在750 Gy和500Gy的輻照劑量下所得濾紙酶活力最高，正突變率也為各劑量中最高，分別達(dá)到了12.0％和11.0％。對這兩個劑量進(jìn)行篩選后得到黑曲霉EBA105和綠色木霉EBT18兩個突變株，其R值分別為3.9和3.5。黑曲霉EBA105的濾紙酶活力為152.5 FPU/mL，纖維素內(nèi)切酶活力為91.4 IU/mL，纖維素外切酶活力為29.6 IU/mL，β-葡萄糖苷酶活

5、力為35.3 IU/mL，較初始菌株提高了2.6倍-3.2倍。綠色木霉EBT18的濾紙酶活力、纖維素內(nèi)切酶活力、纖維素外切酶活力和β-葡萄糖苷酶活力分別為186.9 FPU/mL、108.2 IU/mL、61.3 IU/mL和153.3 IU/mL，較初始菌株提高了3.3倍-3.9倍。對突變體纖維素酶基因的序列分析表明，輻照后的突變以點(diǎn)突變占多數(shù)。
　　 (4)為獲得更高纖維素酶活力的突變體，采用12C6+離子束對黑曲霉EBA1

6、05和綠色木霉EBT18進(jìn)行了再次誘變，黑曲霉孢子的輻照致死劑量為150 Gy，綠色木霉孢子為125 Gy。黑曲霉和綠色木霉分別在80 Gy和70 Gy的輻照劑量下所得濾紙酶活力最高，正突變率也是各劑量中的最高值，分別為11.0％和16.0％。對這兩個劑量進(jìn)行篩選后得到黑曲霉CIA915和綠色木霉CIT626兩個突變株，其R值分別為5.3和.5.5。黑曲霉CIA915的濾紙酶活力為431.6 FPU/mL，纖維素內(nèi)切酶活力為310.8

7、IU/mL，纖維素外切酶活力為106.2 IU/mL，β-葡萄糖苷酶活力為95.9IU/mL，較出發(fā)菌株黑曲霉EBA105提高了2.7倍-3.6倍。綠色木霉CIT626的濾紙酶活力、纖維素內(nèi)切酶活力、纖維素外切酶活力和β-葡萄糖營酶活力分別為535.3 FPU/mL、336.5 IU/mL、231.8 IU/mL，和437.6 IU/mL，較出發(fā)菌株提高了2.9倍-3.8倍。對突變體纖維素酶基因的序列分析表明，主要的突變類型為點(diǎn)突變。<

8、br>　　 (5)采用20Ne10+離子束對黑曲霉EBA105和綠色木霉EBT18進(jìn)行了再次誘變，該重離子束對黑曲霉和綠色木霉孢子的致死劑量分別為125 Gy和100 Gy。黑曲霉和綠色木霉分別在90 Gy和80 Gy的輻照劑量下所得濾紙酶的活力最高，其正突變率也為各劑量中較高，均為9.0％。對這兩個劑量進(jìn)行篩選后得到黑曲霉NIA301和綠色木霉NIT385兩個突變體，其R值分別為3.6和4.2。黑曲霉NIA301的濾紙酶活力為293

9、.8 FPU/mL，纖維素內(nèi)切酶活力為176.5 IU/mL，纖維素外切酶活力為61.3 IU/mL，β-葡萄糖苷酶活力為68.1 IU/mL，較出發(fā)菌株黑曲霉EBA105提高了1.9倍-2.1倍。綠色木霉NIT385的濾紙酶活力、纖維素內(nèi)切酶活力、纖維素外切酶活力和β-葡萄糖苷酶分別為325.2 FPU/mL、183.5 IU/mL、110.2 IU/mL和275.8 IU/mL，較出發(fā)菌株提高了1.7倍-1.8倍。對突變體纖維素酶基

10、因的序列分析表明，輻照后的突變類型以點(diǎn)突變?yōu)橹鳌?br>　　 (6)獲得纖維素酶高產(chǎn)菌株后，對黑曲霉CIA915和綠色木霉CIT626的粗酶液進(jìn)行了精制和配比，結(jié)果表明黑曲霉和綠色木霉的酶液以1:6的比例配比時能獲得最大的濾紙酶活力。最佳的酶輔助提取工藝條件為：初始pH值5.0，溫度40℃，時間6 h，酶濃度150.0 FPU/g，固液比1:2。經(jīng)酶輔助提取后所得金絲桃素的提取率為166.5μg/g，較超聲提取法提高了46.7％。對酶

11、解前后貫葉連翹粉末的微觀結(jié)構(gòu)觀察的結(jié)果表明，樣品經(jīng)纖維素酶降解后微觀形貌發(fā)生了較大變化，這也為纖維素的大量降解提供了佐證。
　　 (7)應(yīng)用微波輔助合成的方法，對金絲桃素合成路線中的大黃素蒽酮縮合反應(yīng)分別在微波加熱溫度、輻射時間和催化劑三個方面進(jìn)行優(yōu)化，確定了最佳的反應(yīng)條件：溫度為150℃，反應(yīng)時間1 h，不使用催化劑。該步反應(yīng)所得收率可達(dá)到82.2％，整個合成路線的總收率為74.3％。
　　 綜上所述，由電子束和12C