1、以國內(nèi)分離的牛源致病性壞死梭桿菌(Fusobacterium necrophorum, F.n.)F4菌株基因組為模板,通過PCR和克隆技術(shù)構(gòu)建高效真核表達載體,體外對重組的融合蛋白進行免疫特性和細胞毒性研究。研究內(nèi)容如下:
　　根據(jù)文獻和生物信息學技術(shù),參考 GenBank已知白細胞毒素序列 accession no.AF312861.3設(shè)計4對引物。利用PCR技術(shù)獲得bsbse、gas-sh和sh三個基因片段,構(gòu)建bsbse,

2、gas-sh和sh三個TA克隆載體,前兩者測序并提交序列。利用T4 DNA Ligase和PCR技術(shù)獲得 bsbse-gas-sh和bsbse-sh兩個融合片段并測序鑒定。構(gòu)建pPIC9K-bsbse-sh和pPIC9K-bsbse-gas-sh真核分泌表達載體,轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體KM71H酵母細胞;經(jīng)過His-營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基,G418抗性培養(yǎng)基篩選和PCR鑒定,成功獲得兩株真核工程菌。研究表明,經(jīng)1.0％甲醇誘導發(fā)酵4 d,BSBSE-SH

3、和BSBSE-GAS-SH融合蛋白分泌到培養(yǎng)物上清液中并表達量最大,SDS-PAGE分析重組蛋白大小分別約為53.2KD和117.9KD。
　　在體外用Western Blot分析目的蛋白的抗原特性,結(jié)果顯示兩條多肽都有印跡帶。但是BSBSE-SH的重組蛋白有大的雜帶,估計是重組蛋白的多聚體;而BSBSE-GAS-SH的帶比較明顯,推測在形成三維結(jié)構(gòu)的時候疏水性片段GAS起了穩(wěn)定、排斥的作用。以小鼠肝上皮細胞(NCTC clone