1、蛋白酶激活受體-2(protease-activated receptor-2,PAR-2)屬于G蛋白偶聯(lián)受體,研究顯示PAR-2廣泛存在于動(dòng)物的胃腸道組織中,具有介導(dǎo)和抵抗炎癥的作用,對(duì)胃腸道疾病有重要的調(diào)節(jié)作用。斷奶仔豬腹瀉(Diarrhea of weaning piglets,PWD)是仔豬在斷奶期間由多種因素引起的腹瀉病的總稱(chēng),仔豬斷奶腹瀉有發(fā)病率高、致死率高的特點(diǎn),嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。本試驗(yàn)把PAR-2和斷奶仔豬腹瀉病聯(lián)系

2、起來(lái),為了闡明PAR-2與斷奶仔豬胃腸道粘膜屏障的關(guān)系,從而了解PAR-2在仔豬腹瀉病理過(guò)程中的作用,為防治“仔豬早期斷奶綜合征”提供一定的依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)從以下列兩個(gè)方面進(jìn)行了分析研究。
　　 1.PAR-2與胃腸粘膜系統(tǒng)在斷奶仔豬腹瀉過(guò)程中相關(guān)性研究
　　 以體重為(10±0.3)kg,25-28日齡的30頭早期斷奶仔豬為研究對(duì)象,對(duì)其中的18頭斷奶仔豬每頭口服接種1.0×1011 cfu/ml的ETEC大腸桿菌5ml而

3、建立腹瀉模型。選取其中腹瀉比較明顯的12頭仔豬作為腹瀉組,12頭健康仔豬作為正常組。在仔豬腹瀉的第1d、3d、5d和第7d屠宰仔豬,采集樣品。取腹瀉組與正常組仔豬的胃腸道組織,利用HE染色觀(guān)察胃腸道組織的病理學(xué)變化；采用免疫組化、WesternBlotting及熒光定量PCR技術(shù)觀(guān)察PAR-2、Claudin-1、Occludin及ZO-1mRNA和蛋白水平上的變化；利用ELISA技術(shù)檢測(cè)血漿中CGRP、IL-6和TNF-α的含量變化,

4、利用生化試驗(yàn)檢測(cè)組織勻漿中磷脂、氨基己糖和血漿中內(nèi)毒素、DAO的含量變化。結(jié)果顯示腹瀉仔豬病理組織學(xué)變化主要表現(xiàn)為胃腸道粘膜上皮細(xì)胞脫落壞死,腸道粘膜層及平滑肌變薄,損傷嚴(yán)重的粘膜固有層內(nèi)有嗜酸性粒細(xì)胞及嗜中性粒細(xì)胞浸潤(rùn),腸絨毛凌亂等。PAR-2在整個(gè)胃腸道中都有表達(dá),腹瀉第3d的PAR-2蛋白與正常組相比表達(dá)量增加(P<0.05),強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)主要存在于粘膜固有層的上皮細(xì)胞的頂端,血管上皮細(xì)胞,腺細(xì)胞的基底部,嗜酸性粒細(xì)胞及中性粒細(xì)胞等

5、,所有的對(duì)照組均無(wú)陽(yáng)性反應(yīng)。PAR-2 mRNA在腹瀉的第1d、3d、5d和第7d都有明顯的增加,且在回腸和結(jié)腸中更明顯。隨著腹瀉時(shí)間的延長(zhǎng),Claudin-1、Occludin及ZO-1在蛋白和基因水平上都有明顯的變化,三種蛋白在回腸和結(jié)腸變化差異顯著,提示隨著腹瀉時(shí)間的延長(zhǎng),胃腸粘膜的損傷越嚴(yán)重,但腸道更為顯著。在仔豬腹瀉的第3d胃黏膜組織中氨基己糖與正常組相比含量降低(P<0.05),而第1d、第5d及第7d不顯著,且均低于正常組

6、。磷脂在腹瀉的第3d和第5d比正常組低(P<0.05),而第1d和第7d差異不顯著,且均低于正常組。腹瀉組仔豬隨著腹瀉時(shí)間的延長(zhǎng),血漿中內(nèi)毒素、TNF-α、IL-6及DAO的含量都顯著或極顯著升高。在仔豬腹瀉的第3-7d,上述各指標(biāo)與正常對(duì)照組相比含量都明顯增加(P<0.01),而在腹瀉的第1d,內(nèi)毒素、DAO雖然高于對(duì)照組(P>0.05)。CGRP與對(duì)照組相比,第1d和第5d差異不顯著,第3d和第7d血漿中的含量明顯降低(P<0.05

7、),且均明顯降低。這部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示PAR-2與仔豬胃腸道粘膜系統(tǒng)呈負(fù)相關(guān)。
　　 2.PAR-2對(duì)豬小腸上皮細(xì)胞IL-6、IL-8的分泌以及TJ連接蛋白的影響研究
　　 取新生仔豬小腸組織,采用酶消化法培養(yǎng)原代小腸上皮細(xì)胞,再進(jìn)過(guò)純化傳代培養(yǎng)形成單層細(xì)胞,在細(xì)胞中添加胰蛋白酶、大豆蛋白酶抑制劑、人工合成PAR-2激動(dòng)劑SLIGRL-NH2、LRGILS-NH2、LPS及LT刺激劑,在刺激時(shí)間分別為2h、14h和24h時(shí)

8、,利用ELISA法檢測(cè)豬小腸上皮細(xì)胞細(xì)胞上清液中IL-6、IL-8的含量,利用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)PAR-2、Claudin-1、Occludin及ZO-1 mRNA水平的變化。結(jié)果顯示,對(duì)照組中小腸上皮細(xì)胞釋放IL-6和IL-8的量很低幾乎可以忽略不計(jì),但是在PAR-2激動(dòng)劑(胰蛋白酶和SLIGRL-NH2)刺激豬小腸上皮細(xì)胞釋放IL-6和IL-8,并且在LPS及LT存在的情況下釋放量更顯著。在刺激24h后,PAR-2激動(dòng)劑組IL-

9、6和IL-8的含量與正常組相比明顯升高(P<0.05),且有LPS+LT存在時(shí)IL-8的含量更高于正常組(P<0.01)。Claudin-1、Occludin及ZO-1 mRNA在PAR-2激動(dòng)劑刺激作用24h后,表達(dá)量明顯低于空白對(duì)照、反激動(dòng)肽、大豆蛋白酶抑制劑組,(P<0.05)其中Claudin-1變化最為明顯。
　　 以上的結(jié)果提示,PAR-2對(duì)胃腸道粘膜屏障有負(fù)調(diào)控作用,在斷奶仔豬腹瀉病理過(guò)程中有一定介導(dǎo)作用。激活后的