1、[目的]：
　　本文通過蛋白組學方法比較豬鏈球菌2型(Streptococcussuisserotype2，SS2)強、無毒株分泌蛋白，分析二者蛋白表達的差異，以期進一步了解SS2的致病機制明確該菌株間致病性存在差異的原因，對今后流行病學的調查有一定的指導意義。
　　[方法]：
　　本實驗以SPF巴馬小型豬及野生型斑馬魚作為動物模型，檢測了SS2菌株感染SPF巴馬小型豬后致病情況，并計算了接種斑馬魚96h內LD50值，

2、確定實驗菌株，強毒株SH-08和無毒株SH-07YH，并以該兩個菌株的基因組為模板，通過PCR的方法擴增與毒力相關的基因cps、mrp、epf、gdh、orf2、gapdh、sly初步判定各個菌株的毒力因子攜帶情況。
　　根據(jù)各菌株培養(yǎng)平板計數(shù)(CFU)結果，對SH-08及SH-07YH菌液，以每1h為間隔，按照倍比稀釋法進行CFU計數(shù)及OD600測定，繪制兩菌株生長曲線，比較細菌生長情況。在菌液OD600為0.4時(前對數(shù)期)，

3、收集菌株的表達上清。按照CFU值定量取SH-08及SH-07YH培養(yǎng)上清量（分別為50ml及76.5ml），并通過BCA技術進行蛋白定量。隨后通過SDS-PAGE技術初步分析兩菌株分泌蛋白表達圖譜，評估后續(xù)定量蛋白組學實驗的可行性。
　　首先通過胰酶分解上清蛋白，采用液質聯(lián)用及串聯(lián)質譜技術進行鑒定研究(ThermoQuest)，隨后經(jīng)電噴霧方法，按照質荷比為400至2000范圍進行全掃描，經(jīng)SEQUEST軟件分析，將肽段信息與SW

4、ISSPORT數(shù)據(jù)庫中所有的鏈球菌種信息進行匹配。運用DeCyderMS軟件將肽段質譜信息轉化為類似雙向電泳圖形式，評價試驗結果質量。基于定量比較蛋白組學的結果，在強毒株SH-08中特異性和高表達的蛋白用PCR和RT－PCR方法進行驗證。
　　采用在線免費軟件SignaIP2.0.B2(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-2.01)進行目的蛋白信號肽預測分析，含有信號肽蛋白通過PSORTI

5、(http://psort.nibb.ac.jp/)軟件進一步分析目的蛋白的細胞定位。
　　選擇在強毒株SH-08及弱毒株SH-07YH中共表達，且在強毒株SH-08中表達上調的蛋白，將其定量蛋白數(shù)據(jù)及定量PCR數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計線型回歸分析(SPSS16.0)，確定蛋白高表達與轉錄水平的相關性。
　　[結果]：
　　(1)動物致病力實驗，SPF巴馬小型豬在感染強毒株SH-08后均出現(xiàn)急性敗血癥并死亡，而無毒株SH-07YH

6、感染后只有輕微的發(fā)熱現(xiàn)象。斑馬魚(LD50)結果表明菌株SH-08的毒力遠高于SH-07YH，明確了兩株細菌的致病力，為接下來的研究奠定了基礎。
　　(2)PCR方法擴增與毒力相關基因，表明SH-08與背景已知的強毒株ZY05719所含的主要毒力基因一致，相比而言，無毒株SH-07YH僅缺失了毒力基因fbps，而其他大部分毒力基因都存在，推測毒力因子缺失并非是造成致病力差異的關鍵原因。
　　(3)SDS-PAGE電泳鑒定SH

7、-08與SH-07YH上清蛋白表達基本一致，但SH-08菌株存在更多的蛋白條帶，部分蛋白條帶表達量相比SH-07YH顯著上調。結果證實后續(xù)定量蛋白組學實驗具有可行性。
　　(4)本研究通過基于非標定量蛋白組學方法，結合DecydeMS軟件進行豬鏈球菌2型強毒株SH-08及弱毒株SH-07YH分泌蛋白進行定量研究，結果證實了相比弱毒株SH-07YH，強毒株SH-08含有11個高表達分泌蛋白，29個特異性分泌蛋白。推測這些差異表達的蛋

8、白可能與菌株毒力相關，為豬鏈球菌2型的毒力因子研究奠定了基礎，為后續(xù)致病機制研究提供借鑒。
　　[結論]：
　　(1)應用野生型斑馬魚作為動物模型，比較了SS2菌株ZY05719、SH-07YH和SH-08之間的LD50。其中ZY05719株LD50值最低，其次為SH-08株，SH-07YH株LD50值則最高。表明菌株SH-08的毒力遠高于SH-07YH。
　　(2)本研究通過基于非標定量蛋白組學方法，結合Decyde