1、水稻是世界重要的糧食作物。目前,隨著全球耕地面積的不斷減少,糧食危機逐漸顯現(xiàn),為了滿足糧食需求,人們大量地向農(nóng)田施入各種化學(xué)肥料以保證產(chǎn)量,特別是氮肥,因為氮肥是影響和制約糧食產(chǎn)量的最為重要的因素之一。然而,大量施入氮肥帶來了許多負(fù)面影響,例如生產(chǎn)成本增加、經(jīng)濟浪費以及環(huán)境污染。傳統(tǒng)的育種手段已經(jīng)無法滿足人們?nèi)找嬖鲩L的糧食需求。因此,利用分子生物學(xué)技術(shù)快速高效地獲得氮高效吸收和利用的轉(zhuǎn)基因水稻新品種對我國水稻生產(chǎn)甚至是整個農(nóng)業(yè)發(fā)展起著十

2、分重要的意義。另外,各種非生物逆境(干旱、冷害和高鹽等)對植物尤其是作物的生長和發(fā)育也有著非常重要的影響,因此研究和逆境相關(guān)的基因?qū)μ岣咦魑飳Ω珊怠⒏啕}和低溫等逆境的耐受能力具有重要意義。本研究通過超量表達低氮誘導(dǎo)表達基因、銨鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因(AM7)和硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因(NR7),對轉(zhuǎn)基因植株進行表型分析和生理生化研究,以獲得氮高效吸收和利用的轉(zhuǎn)基因水稻新品種；通過對C3HC4類型的鋅指蛋白家族成員進行生物信息學(xué)分析以及脅迫條件下的表達

3、分析,找到一些和逆境相關(guān)的鋅指蛋白成員。主要結(jié)果如下:
　　 1.使用生物信息學(xué)方法在NCBI數(shù)據(jù)庫搜索獲得水稻低氮誘導(dǎo)表達基因、銨鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因(AMT)和硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因(NRT)的序列信息；并通過cDNA文庫和PCR擴增獲得基因。以載體pCAMBIA1301S為基礎(chǔ),構(gòu)建超量表達載體,以35S啟動子啟動基因在水稻中進行組成型大量表達。通過Southern和Northernrn雜交,對轉(zhuǎn)基因植株進行轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)和表達量的檢

4、測,來獲得超量表達的單拷貝轉(zhuǎn)基因植株。對轉(zhuǎn)基因植株進行水培篩選和田間鑒定,找到和野生型植株表型有差異的轉(zhuǎn)基因植株進行下一步研究。
　　 2.用Real-time PCR的方法檢測水稻全生育期27個組織和器官中10個銨鹽轉(zhuǎn)運子基因(OsAMT1；1.OsAMT1:2,OsAMT1;3,OsAMT2;1,OsAMT2;2,OsAMT2；3,OsAMT3;1,OsAMT3;2,OsAMT3;3,OsAMT4;1)的表達水平。結(jié)果表明:

5、OsAMT1;1,OsAMT1;2,OsAMT2；1和OsAMT4；1在27個組織或器官中廣泛表達,屬于組成型表達的銨鹽轉(zhuǎn)運子,然而另外6個銨鹽轉(zhuǎn)運子基因特異地在某些組織或器官中表達如根,幼穗、胚乳等等。
　　 3.用Real-time PCR的方法檢測氮饑餓以及不同氮源處理條件下銨鹽轉(zhuǎn)運子基因的表達變化。結(jié)果表明在缺氮條件下6個銨鹽轉(zhuǎn)運子(OsAMT1；3,OsAMT2;1,OsAMT2;3,OsAMT3；1,OsAMT3；2

6、,OsAMT4；1)在地上部和地下部中的表達不發(fā)生改變,另外在不同的時間點5個基因在地上部或地下部的表達發(fā)生變化。另外,經(jīng)過不同氮源處理后植株根中除了OsAMT1；1外,其他的銨鹽轉(zhuǎn)運子基因在轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生改變。這些結(jié)果表明大多數(shù)的銨鹽轉(zhuǎn)運子基因在轉(zhuǎn)錄水平上至少能被一種氮源所影響,并且在氮饑餓條件下,一部分銨鹽轉(zhuǎn)運子基因的轉(zhuǎn)錄水平會快速發(fā)生改變使得植株能夠適應(yīng)外界改變的環(huán)境。
　　 4.利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化的方法將OsAMT2

7、；1和OsAMT2；3這兩個基因分別導(dǎo)入到水稻中花11中進行超量表達。經(jīng)過水培篩選發(fā)現(xiàn),和野生型對照中花11,超表達OsAMT2；1的轉(zhuǎn)基因植株長勢瘦弱,鮮重和分蘗數(shù)和對照相比分別減少30％,轉(zhuǎn)基因植株根內(nèi)游離銨含量和總氮含量大約上升了10％。超表達OsAMT2；3的轉(zhuǎn)基因植株同樣長勢瘦弱,植株的鮮重和分蘗數(shù)與對照相比減少了大約30％,轉(zhuǎn)基因植株根內(nèi)的游離銨含量下降了10％。通過15N的吸收實驗同樣證明了超表達OsAMT2；3的轉(zhuǎn)基因植

8、株吸收銨的能力大約下降了10-15％。
　　 5.水稻中典型的C3HC4類型的鋅指蛋白OsRHC一共有29個成員,對它們的基因結(jié)構(gòu)、順式作用因子、染色體定位、進化關(guān)系、以及表達作了系統(tǒng)的分析,并通過Real-time PCR對部分OsRHC基因在激素處理和逆境脅迫條件下的表達變化做出研究。分析結(jié)果表明29個OsRHC基因中有5個C3HC4型鋅指蛋白成員特異地在生殖器官中表達,在非生物脅迫下12個基因在苗期受到激素或逆境的調(diào)節(jié)。這