1、據(jù)稱，內源性反轉錄病毒(Endogenous retroviruses，ERVs)是遠古反轉錄病毒感染時留下的痕跡，構成了機體“virome”的重要組成部分。過去對內源性反轉錄病毒的功能不夠了解，曾將其視為“垃圾DNA”(Junk DNA)。但最近有研究表明，某些內源性反轉錄病毒不僅對早期胚胎發(fā)育和胚胎干細胞的多能性具有重要作用，還可能與病毒感染、天然免疫以及抗腫瘤作用有關。本研究選擇內源性反轉錄病毒一雞內源性白血病病毒(Avianle

2、ukosis virus subgroup E，ALVE)作為研究模型，應用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對雞1號染色體上存在的內源性反轉錄病毒ALVE1進行去表達以探索其與天然免疫之間的關系，為進一步研究內源性反轉錄病毒的功能和作用奠定基礎。
　　本研究通過CRISPR/Cas9技術將轉錄終止序列(SV40 ployA)敲入內源性反轉錄病毒ALVE1的啟動子區(qū)，通過終止其轉錄從而實現(xiàn)ALVE1的去功能(Loss of functio

3、n)。本文不僅成功構建了針對家禽內源性反轉錄病毒去功能研究的新方法，還為今后研究內源性反轉錄病毒的功能提供了新思路。主要的研究結果如下:
　　1、ALVE1的鑒定及轉錄表達分析:首先，應用反式PCR(Inverse PCR)與cDNA末端快速擴增(Rapid amplification of cDNA ends，RACE)技術，成功鑒定了ALVE1在雞1號染色體的具體位置信息，獲得了完整的ALVE1序列。然后，將ALVE1序列分成

4、三部分，分別設計引物進行PCR擴增，結果顯示:在雞巨噬細胞系HD11中含有完整的ALVE1序列，而在雞成纖維細胞系DF-1中缺乏ALVE1序列。最后，通過PCR鑒定ALVE1在HD11中的轉錄情況。結果表明: ALVE1的四個區(qū)域（即LTR、gag、pol和env）在雞巨噬細胞系HD11中均能轉錄表達。
　　2、轉錄終止元件的篩選:為了篩選高效的轉錄終止序列，本研究構建了含有轉錄終止序列以及綠色熒光蛋白GFP的載體，通過對GFP熒

5、光的觀察以及熒光定量PCR檢測，分別比較SV40 polyA、4×SV40 polyA、β-globin和β-globin△5-7四個轉錄終止序列的終止效率。結果顯示:四個轉錄終止序列都有較高的終止活性，其終止效率均高于90％。在四個終止序列中，由于SV40 polyA的序列最短，本文最終選定SV40 polyA作為本研究的終止元件。在此基礎上，本文還繼續(xù)探索了正向與反向SV40 polyA的終止效率，結果表明:正向與反向的SV40 p

6、olyA均有轉錄終止活性，但是反向序列的終止活性遠低于正向序列。
　　3、CRISPR/Cas9介導的ALVE1轉錄終止及其功能初探:為了實現(xiàn)ALVE1去功能以研究其與天然免疫之間的關系，本文構建了含有轉錄終止序列的同源重組載體，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)將其敲入ALVE1的啟動子區(qū)，然后通過嘌呤霉素(Puromycin)和新霉素(Neomycin)雙篩選，最終獲得了ALVE1被終止轉錄的雞巨噬細胞系(命名為:HD11-ALV