1、灰霉病(Botrytis cinerea)是葡萄采后病害中最具毀滅性的病害之一。長(zhǎng)期以來,SO2熏蒸等被認(rèn)為是最有效的防治措施。隨著人們對(duì)于農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染以及人類健康等方面的不斷關(guān)注,迫切需要新型高效、環(huán)保、無(wú)毒的生物保鮮劑來取而代之。
　　 本研究旨在分離、篩選能有效抑制葡萄采后灰霉病的生防酵母菌株,建立該菌株的作用模式,并通過添加外源物質(zhì)進(jìn)一步提高其生防能力。通過對(duì)該酵母菌株作用機(jī)理進(jìn)行研究,建立包括營(yíng)養(yǎng)空間競(jìng)爭(zhēng)、寄生、

2、誘導(dǎo)抗性及產(chǎn)生抑菌物質(zhì)等在內(nèi)的綜合抑菌機(jī)理模式。主要結(jié)果如下:
　　 1.從葡萄果實(shí)及果實(shí)傷口處共分離到酵母菌株248株。通過離體篩選得到10個(gè)菌株對(duì)灰霉病有明顯的拮抗作用。其中,濃度為1.0×108個(gè)/mL的菌株P(guān)-2對(duì)1.0×105spore/mL灰霉菌的抑菌圈可達(dá)到23.08 mm。進(jìn)一步活體篩選得到可顯著抑制葡萄灰霉病的生防菌P-2。果實(shí)接種處理6 d后,1.0×108個(gè)/mL菌株P(guān)-2可完全抑制果實(shí)發(fā)病。
　　

3、 葡萄果實(shí)貯藏實(shí)驗(yàn)結(jié)果:貯藏50 d后,生防菌P-2處理后果實(shí)的發(fā)病率為15％,與多菌靈處理后的果實(shí)發(fā)病率(14％)無(wú)顯著差異。此外,生防菌P-2可在一定程度上降低葡萄貯期內(nèi)的果實(shí)脫粒率。貯藏50 d后,生防菌P-2處理后的葡萄果實(shí)脫粒率為28％,與對(duì)照處理(40％)差異顯著。
　　 生防菌P-2處理對(duì)葡萄果實(shí)的可溶性固形物含量、可滴定酸和Vc含量無(wú)顯著影響,不影響果實(shí)品質(zhì)。
　　 2.生防菌P-2對(duì)于葡萄采后灰霉菌的最

4、佳作用模式:與培養(yǎng)原液、無(wú)菌濾液相比,菌株P(guān)-2細(xì)胞懸浮液對(duì)于灰霉菌的生防效果最佳,抑病率可達(dá)到90％。菌株P(guān)-2供試濃度為1.0×108個(gè)/mL時(shí)生防效力最佳,可以完全抑制1.0×104 spores/mL、1.0×105 spores/mL和1.0×106 spores/mL灰霉菌生長(zhǎng)；先接種菌株P(guān)-2后接種灰霉菌處理的生防效力最佳,與生防菌和病原菌同時(shí)接種相比,接種菌株P(guān)-2后2 h,24 h和48 h再接種灰霉菌的果實(shí)發(fā)病率明顯

5、降低。
　　 3.拮抗酵母菌鑒定:經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化指標(biāo)及rDNA-ITS序列分析對(duì)菌株P(guān)-2進(jìn)行了鑒定。結(jié)果表明:菌株P(guān)-2為漢遜酵母屬(Hanseniaspora)葡萄汁有孢漢遜酵母(Hanseniaspora uvarum)。
　　 4.通過對(duì)H.uvarum P-2拮抗機(jī)理進(jìn)行初步探討,發(fā)現(xiàn)其可能存在的作用機(jī)理如下:
　　 (1)顯著抑制灰霉菌孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)。生防菌P-2對(duì)于灰霉孢子萌發(fā)及菌絲生長(zhǎng)的抑

6、制率分別達(dá)到88％和70％。
　　 (2)可在葡萄果實(shí)傷口處迅速定殖生長(zhǎng),與灰霉菌間形成強(qiáng)有力的競(jìng)爭(zhēng)作用。在灰霉菌存在或者不存在的情況下,生防菌P-2均可在果實(shí)傷口處迅速定殖和生長(zhǎng)。營(yíng)養(yǎng)空間競(jìng)爭(zhēng)可能是生防菌P-2的抑菌機(jī)理之一。
　　 (3)在常溫貯藏條件下,生防菌P-2處理能夠顯著提高果實(shí)過氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸裂解酶(PAL)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)及β-1,3-葡

7、聚糖酶等抗病性相關(guān)酶活性,因此推測(cè)誘導(dǎo)抗性可能是H.uvarum P-2的抑菌機(jī)理之一。
　　 (4)通過顯微鏡觀察,可發(fā)現(xiàn)生防菌P-2能緊密吸附在灰霉菌菌絲體上,推測(cè)菌株P(guān)-2與灰霉菌之間可能存在寄生關(guān)系。
　　 (5)從菌株P(guān)-2無(wú)菌發(fā)酵液中分離到抑菌物質(zhì)粗提物。其生理生化性質(zhì)研究結(jié)果表明:粗提物對(duì)葡萄、芒果和柑橘主要采后病害表現(xiàn)強(qiáng)抑制作用；經(jīng)121℃高溫高壓處理20 min、蛋白酶K、胰蛋白酶處理,均不能破壞其抑菌

8、活性；且該粗提物呈酸性。
　　 優(yōu)化該抑菌物質(zhì)粗提物發(fā)酵條件,結(jié)果表明:在自然pH值條件下,接種量為1％,搖瓶裝液量為50 ml/250 ml,培養(yǎng)36 h～48 h時(shí),抑菌物質(zhì)產(chǎn)量較大。
　　 5.生防菌P-2生防效力改良實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:鉬酸銨(NH4-Mo)、硅酸鈉(Na2SiO3)、碳酸氫鈉(NaHCO3)和茶多酚(tea polyphenol)等物質(zhì)均在一定濃度下顯著提高生防菌P-2抑菌能力。氯化鈣(CaCl2)不