1、小尾寒羊是我國重要瀕危物種之一，構(gòu)建小尾寒羊的cDNA文庫對于小尾寒羊遺傳資源的保護具有重要意義。本研究運用SMARTTM技術(shù)成功地構(gòu)建了小尾寒羊的cDNA文庫。以小尾寒羊耳緣組織為試驗材料，用GENMED試劑盒提取總RNA，核酸蛋白檢測儀測其OD260/280值為1.98，甲醛變性電泳后出現(xiàn)兩條帶：28S和18S，其亮度約比為2:1。以提取的RNA作為模板，用LD-PCR法擴增cDNA的第二條鏈，瓊脂糖電泳檢測顯示一條彌散的帶，大小在

2、4Kb以下，用Sfi內(nèi)切酶切割ds-cDNA后，回收酶切的大片段，將其與λ噬菌體連接，然后用包裝蛋白進行包裝、再擴增，即得到小尾寒羊cDNA文庫。檢測小尾寒羊cDNA文庫的容量、重組率以及插入片段長度。所構(gòu)建的cDNA文庫擴增后文庫的滴度為1.5×1010pfu/mL，重組率為95.83％，插入片段平均大小為910bp。
　　 運用PCR擴增法，從小尾寒羊cDNA文庫中篩選了核糖體蛋白基因RPL23A，測序結(jié)果與Genbank進

3、行比對，相似度達到96％。本試驗采用了雙酶切法成功地構(gòu)建了RPL23A基因的真核表達載體pEGFP-N3-RPL23A和原核表達載體pGEX--4T-1-RPL23A。SDS-PAGE和Westernblot檢測pGEX-4T-1-RPL23A融合蛋白的表達情況，結(jié)果顯示，在42kD左右的位置出現(xiàn)RPL23A融合蛋白的表達帶，表明RPL23A基因在BL21菌中表達成功。
　　 試驗中采用貼壁法培養(yǎng)了烏珠穆沁羊成纖維細胞，利用脂質(zhì)

4、體2000介導(dǎo)法將pEGFP-N3-RPL23A導(dǎo)入體外培養(yǎng)的烏珠穆沁羊成纖維細胞中。共聚焦顯微鏡觀察RPL23A基因在細胞中的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)染后24、48和72h，綠色融合蛋白在烏珠穆沁羊成纖維細胞的細胞核與細胞質(zhì)均有分布。轉(zhuǎn)染后24h熒光在細胞中分布均勻，48h后細胞核中表達強于細胞質(zhì)并達到峰值，72h后熒光強度逐漸衰弱，細胞逐漸凋亡。重組融合蛋白的轉(zhuǎn)染率在9.7％～22.8％之間。
　　 綜上所述，本試驗成功構(gòu)建