1、腸炎沙門氏菌(Salmonella enteritidis,SE)是一類泛嗜性沙門氏菌，它不僅能引起肉雞和蛋雞的發(fā)病，造成嚴重的經(jīng)濟損失，而且是引起人類食物中毒的主要病原菌之一，在獸醫(yī)公共衛(wèi)生學(xué)上具有重要意義。菌毛結(jié)構(gòu)在細菌致病過程中有著很重要的作用，研究表明菌毛結(jié)構(gòu)與感染早期對宿主特定靶組織的定植和黏附有關(guān)，同時，它也能作為一種針對上皮細胞表面病原菌的潛在免疫原。腸炎沙門氏菌能表達多種菌毛結(jié)構(gòu)，其中SEF14菌毛是90年代分離出來的，

2、僅在腸炎沙門氏菌和都柏林沙門氏菌中表達。目前，關(guān)于SEF14菌毛的功能仍在探討之中。
　　 為了研究SEF14菌毛的功能及其在腸炎沙門氏菌致病過程中的作用，本試驗利用高效自殺性載體系統(tǒng)和Red同源重組系統(tǒng)對3種不同來源腸炎沙門氏菌(包括國內(nèi)標準株50336、禽源分離株S.09以及人源分離株43)SEF14菌毛操縱子亞單位sefA和sefD編碼基因進行敲除，并對這兩種系統(tǒng)進行比較。本試驗成功構(gòu)建了腸炎沙門氏菌國內(nèi)標準株50336、

3、禽源分離株S.09以及人源分離株43的sefA和sefD基因缺失株各3株，并在△sefA缺失株的基礎(chǔ)上又運用Red同源重組系統(tǒng)再次進行了sefD基因的缺失突變，構(gòu)建了雙缺失突變株△sefA△sefD各3株。高效自殺性載體系統(tǒng)需要構(gòu)建含同源DNA片段的重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化宿主菌，其一次重組效率高；二次重組只需用含5％蔗糖的平板傳代即可進行抗性質(zhì)粒丟失，且在染色體上不留任何痕跡，但重組效率低。而Red同源重組系統(tǒng)能將PCR擴增產(chǎn)物一步法直接轉(zhuǎn)化入

4、腸炎沙門氏菌，通過同源臂發(fā)生同源重組交換缺失sefD基因。由于對PCR產(chǎn)物和感受態(tài)細胞的質(zhì)量要求很高，故一次重組率低，而二次重組則相對簡單高效，最后在染色體上殘留FRT位點。雖然兩個系統(tǒng)都能對腸炎沙門氏菌染色體進行直接修飾，且都無抗性選擇標志的殘留，但實際操作中，Red同源重組系統(tǒng)較傳統(tǒng)的高效自殺性載體系統(tǒng)更簡便而高效。
　　 基于上述構(gòu)建的SEF14菌毛缺失突變株，比較并分析3株野生株和其對應(yīng)突變株△sefA、△sefD及△s

5、efA△sefD與腸上皮細胞IPEC-J2的黏附試驗，以及小鼠腹腔巨噬細胞吞噬試驗和在巨噬細胞內(nèi)的存活試驗。結(jié)果表明：所有野生株及其相應(yīng)突變株在試驗4h內(nèi)均能很好的與腸上皮細胞黏附，并隨著時間的延長其黏附數(shù)量不斷增多，但野生株與其相應(yīng)突變株在黏附數(shù)量上的差異不顯著，因而推測在體外試驗中SEF14菌毛可能并不介導(dǎo)腸炎沙門氏菌與小腸上皮細胞的黏附。而在與小鼠腹腔巨噬細胞作用的4h內(nèi)時，活化的小鼠腹腔巨噬細胞對相應(yīng)突變株△sef4、△sefD