1、巴貝斯蟲是一類經(jīng)蜱傳播,紅細胞內寄生的原蟲,屬于復頂亞門,由該類寄生蟲引起的牛的巴貝斯蟲病(babesiosis)在世界上許多地區(qū)發(fā)生和流行,是引起熱帶和亞熱帶地區(qū)牛巴貝斯蟲病的主要病原。我國已有14個省(區(qū))報道有本病存在,主要病原為牛巴貝斯蟲(Babesia bovis)和雙芽巴貝斯蟲(Babesia bigemina),?；荚摷纳x病后,常出現(xiàn)貧血、精神沉郁、發(fā)熱、血紅蛋白尿、共濟失調等癥狀,嚴重時引起死亡,給畜牧業(yè)和國民經(jīng)濟造成

2、巨大損失。所以對該病的研究就顯得十分重要。目前,檢測巴貝斯蟲病的方法有血液樣品的血涂片鏡檢技術,血清學檢查,一般PCR檢測技術等,但是這些方法存在低敏感性,交叉感染,假陽性率高的缺點,而且有的方法儀器設備要求比較高,價格昂貴,如實時定量PCR技術。環(huán)介導等溫擴增技術(LAMP)是Notomi等在2000年發(fā)明的一種新穎的恒溫核酸擴增方法。作為一種靈敏的鏈置換技術,它可以在恒溫條件下短時間內將目的DNA從幾個拷貝擴增到109-1010拷貝

3、。本研究以巴貝斯蟲細胞色素b為靶基因,建立簡單、高效、快速的巴貝斯蟲屬及牛巴貝斯蟲和雙芽巴貝斯蟲種的LAMP檢測方法,該方法可用于動物巴貝斯蟲病的診斷,尤其對該病的早期診斷具有重要的現(xiàn)實意義。從GenBank中獲得巴貝斯蟲屬內各個種的細胞色素b基因序列,應用BLAST進行比對,找出保守區(qū)域,根據(jù)LAMP引物設計的原則,設計屬的特異性引物,建立了針對巴貝斯蟲屬的細胞色素b基因的LAMP檢測方法。以牛的巴貝斯蟲的細胞色素b基因為模板,進行L

4、AMP法擴增,并將產(chǎn)物克隆到pMD18-T載體后測序。結果表明,擴增的目的片段大小為254 bp,與預期擴增大小一致。該LAMP檢測體系的特異性強,不能在牛瑟氏泰勒蟲DNA、馬泰勒焦蟲DNA、弓形蟲DNA、羊泰勒焦蟲DNA中擴增出條帶;敏感性高,雙芽巴貝斯蟲最低檢測的DNA含量為0.85 fg/μL,牛巴貝斯蟲最低檢測的DNA含量為0.14 fg/μL。為了進一步檢測巴貝斯蟲種的分類,本研究建立了牛雙芽巴貝斯蟲種的LAMP檢測方法。根據(jù)

5、公布的牛雙芽巴貝斯蟲細胞色素b的DNA序列設計特異性引物,構建牛巴貝斯蟲病的LAMP檢測體系。對巴貝斯蟲樣品進行LAMP擴增并將產(chǎn)物克隆到pMD18-T載體后測序。結果表明,擴增的目的片段符合預期的設計。該LAMP檢測體系的特異性強、敏感性高,牛雙芽巴貝斯蟲細胞色素b基因能夠檢測到的最低含量為0.085 fg/μL。該檢測體系的成功構建為動物感染牛巴貝斯蟲病的診斷和流行病學調查提供了技術支撐。針對牛巴貝斯蟲病也是目前危害牛健康的主要常見

6、病,本研究還建立了牛巴貝斯蟲種的LAMP檢測方法。根據(jù)公布的牛巴貝斯蟲細胞色素b的DNA序列設計特異性引物,應用LAMP方法對巴貝斯蟲樣品進行擴增并進行敏感和特異性檢測。結果表明,該LAMP檢測體系的敏感性高,牛巴貝斯蟲細胞色素b基因能夠檢測到的最低含量為0.014 fg/μL。特異性較強,除能擴增出牛巴貝斯蟲的特異性片段外,雙芽巴貝斯蟲DNA、馬泰勒焦蟲DNA、羊泰勒焦蟲DNA等為模板都不能擴增特異性條帶。該方法可用于牛感染牛巴貝斯蟲