1、本文利用表面展示質(zhì)粒 pINA1317-YICPW110將來源于假單胞菌(Pseudomonas sp.)WBC-3的甲基對硫磷水解酶(methyl parathion hydrolase, MPH)展示在解脂耶羅威亞酵母(Yarrowia lipolytica)Po1h細(xì)胞表面，研究了重組工程菌的催化特性和降解性能。該工程菌安全無害、不攜帶抗性基因、目的基因表達(dá)無需誘導(dǎo)且可穩(wěn)定遺傳，而且避免了采用非表面展示重組工程菌進(jìn)行甲基對硫磷降解

2、時需要破碎細(xì)胞、酶純化時活性降低、酶與底物接觸不充分等問題；為進(jìn)一步提高全細(xì)胞酶的重復(fù)使用性和連續(xù)操作的穩(wěn)定性，通過將綠色木霉(Trichoderma Viride)內(nèi)切葡聚糖酶IV(EG IV)的纖維素結(jié)合域(cellulose binding domain, CBD)與甲基對硫磷水解酶的融合蛋白展示在Y. lipolytica Po1h細(xì)胞表面，構(gòu)建了可特異吸附于纖維素基質(zhì)上的全細(xì)胞甲基對硫磷水解酶，采用固定化全細(xì)胞酶對甲基對硫磷進(jìn)

3、行降解研究，解決了甲基對硫磷水解酶采用常規(guī)固定化方法出現(xiàn)的活力下降、操作繁瑣、費用昂貴等問題。本文構(gòu)建了一種操作簡便、穩(wěn)定高效、安全無害的固定化全細(xì)胞甲基對硫磷水解酶，開辟了國內(nèi)甲基對硫磷降解的新思路和新手段，為甲基對硫磷降解提供了理論依據(jù)和技術(shù)支撐。主要研究結(jié)果如下：
　　(1)利用表面展示質(zhì)粒pINA1317-YlCWP110將Pseudomonas sp.WBC-3的甲基對硫磷水解酶在Y. lipolytica Po1h上進(jìn)

4、行了表面展示，通過免疫熒光檢測和蛋白酶敏感性分析確定甲基對硫磷水解酶已成功展示于Y. lipolytica Po1h細(xì)胞表面。篩選得到甲基對硫磷水解酶酶活力最高的轉(zhuǎn)化子Z51，其甲基對硫磷水解酶比酶活力為36.5±0.5 U/mg cells(450.6±7.3 U/mL cell suspension)，酶活力優(yōu)于已有的多種重組表達(dá)的甲基對硫磷水解酶活力。
　　(2)表面展示甲基對硫磷水解酶的最適作用pH為9.5，在pH4.0-

5、11.5之間較穩(wěn)定；最適作用溫度為40℃，在40℃以下穩(wěn)定性較好。Co2+、Mn2+、Ni2+、Cu2+對表面展示甲基對硫磷水解酶活性有激活作用，Ag+、Li+、Ba2+、Hg2+對展示酶活力有抑制作用，K+、Zn2+、Ca2+、Mg2+、Fe2+、Fe3+、Na+對展示酶活力沒有明顯的影響。在10.0mL反應(yīng)體中的最佳水解條件為100mg/L甲基對硫磷、2.6×107 cells/ml表面展示甲基對硫磷水解酶的酵母細(xì)胞、反應(yīng)時間30

6、min，甲基對硫磷水解率可達(dá)90.8％。全細(xì)胞酶終濃度為2×107 cells/ml、甲基對硫磷濃度為20.0 mg/L的不同水體40℃、180 rpm振蕩反應(yīng)40 min，甲基對硫磷的降解率依次為淡水(pH9.5)98.7%、淡水(pH6.8)97.0%、海水(pH9.5)96.5%和海水(pH8.2)94.4%，全細(xì)胞酶重復(fù)使用4次后，仍可保持70%以上的活力。全細(xì)胞酶在4℃放置30天，仍能保持94%的活性。
　　(3)采用重

7、疊延伸PCR技術(shù)，構(gòu)建綠色木霉EG IV的CBD和Pseudomonas sp.WBC-3 MPH的融合基因片段，利用表面展示質(zhì)粒pINA1317-YlCWP110將MPH-CBD融合蛋白在Y. lipolytica Po1h酵母上進(jìn)行了表面展示，通過免疫熒光檢測和蛋白酶敏感性分析確定MPH-CBD融合蛋白已成功展示于Y. lipolytica Po1h細(xì)胞表面。篩選得到甲基對硫磷水解酶酶活力最高的轉(zhuǎn)化子M3，其甲基對硫磷水解酶比酶活力

8、為33.1±1.1 U/mg cells(381.0±9.2 U/mL cell suspension)，甲基對硫磷水解酶的活性基本未受到CBD的影響。
　　(4)表面展示MPH-CBD融合蛋白的轉(zhuǎn)化子M3細(xì)胞吸附纖維素基質(zhì)的最適pH為8.0，最適溫度為4℃，在4℃-40℃之間具有良好的吸附性。M3細(xì)胞通過表面展示的MPH-CBD融合蛋白對纖維素基質(zhì)具有較高的吸附能力，且細(xì)胞與纖維素基質(zhì)的的結(jié)合非常牢固。將M3細(xì)胞固定于微晶纖維素