1、褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)是我國重要的海水養(yǎng)殖魚類之一,近年來,隨著褐牙鲆人工養(yǎng)殖規(guī)模的快速發(fā)展,各種疾病隨之發(fā)生,尤其是病毒性病害給我國牙鲆養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失,因此對牙鲆免疫機理的研究對于控制牙鲆病害具有重要的意義。褐牙鲆屬于低等脊椎動物,干擾素系統(tǒng)是其實現(xiàn)免疫防衛(wèi)功能的重要分子基礎。干擾素調(diào)節(jié)因子(Interferon regulatory factors,IREs)-3和-7屬于干擾素調(diào)節(jié)因子家

2、族成員,它們是一類多功能的轉(zhuǎn)錄因子,在調(diào)節(jié)干擾素和干擾素刺激基因的轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)揮了重要的作用。目前,褐牙鲆IRF-3和-7尚未被克隆。
　　 本文采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(reverse traasedption-polymerase chain reaction,RT-PCR)和cDNA末端快速擴增(Rapid Amplification of cDNA ends,RACE)方法從褐牙鲆頭腎組織中克隆出IRF-3和IRF-7

3、的全長cDNA分子。IRF-3cDNA有兩種長度不同的變異體(GenBank登錄號:GU017417,GU017418),它們是由Poly(A)加尾位點不同所致。褐牙鲆IRF-3 cDNA分子包含1404 bp開放性閱讀框,編碼464個氨基酸,5'非翻譯區(qū)(5'UTR)長245 bp,長變異體3'非翻譯區(qū)(3'UTR)長553 bp,短變異體3'UTR長327 bp。推斷的IRF-3氨基酸序列中擁有DNA結(jié)合域(DBD)、IRF相關(guān)域(

4、IAD)、絲氨酸富含域(SRD)等功能域。褐牙鲆IRF-7 cDNA(GenBank登錄號:GU017419)由2032 bp組成,包括1293 bp編碼區(qū),編碼430個氨基酸,5'UTR長84 bp,3'UTR長655 bp,推斷的氨基酸序列也具有典型的DBD、IAD和SRD結(jié)構(gòu)域。序列分析表明褐牙鲆IRF-3與mF-7分別與其它脊椎動物的IRF-3與IRF-7有較高的同源性,進化分析將褐牙鲆IRF-3和IRF-7分別聚類于脊椎動物I

5、RF-3和IRF-7分子簇,并同屬于IRF-3亞家族。
　　 采用RT-PCR方法進行了IRF-3和IRF-7的組織分布研究。結(jié)果表明,IRF-3基因在體腎、脾和皮膚中表達水平較高,中等程度表達于食道、胃、腸、膀胱、肌肉、頭腎,而在腦、咽和性腺中表達最弱。牙鲆IRF-7基因在各個組織中都有較明顯的表達,其中在腦、鰓、咽、食道、胃、腸和膀胱中呈現(xiàn)高水平的表達,在心臟、頭腎、體腎、脾、性腺和皮膚中中等程度的表達。
　　 為了

6、解褐牙鲆IRF-3和IRF-7基因的表達規(guī)律及其在干擾素信號系統(tǒng)中的地位與作用,本文利用real time PCR技術(shù)檢測多聚肌胞(PolyI:C)刺激和淋巴囊腫病毒(LCDV)感染對褐牙鲆IFN-I(GenBank登錄號:AB511962)、IFN-γ(GenBank登錄號:AB435093)、IRF-3、IRF-7、Mx(GenBank登錄號:AB110446)基因在牙鲆細胞(FG9307)和頭腎中的表達影響及并分析了它們的聯(lián)動表達

7、規(guī)律。研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)PolyI:C刺激或LCDV感染牙鲆細胞后,IRF-3、IRF-7、IFN-γ和Mx基因均上調(diào)表達,而IFN-I基因的表達卻沒有檢測到。在PolyI:C刺激細胞組中,IRF-3和IRF-7的表達峰值出現(xiàn)在24h,均約為對照水平的3倍;IFN-γ的表達峰值出現(xiàn)在48h,為對照水平的4倍;Mx的表達峰值出現(xiàn)在48h,約為對照水平的7倍。在LCDV感染細胞組中,IRF-3和IRF-7的表達峰值出現(xiàn)在72h,分別是對照水平的7

8、和6倍;IFN-γ在48h后開始檢測到上調(diào)表達,于96h達到峰值,為對照水平的5倍;Mx的表達峰值出現(xiàn)在96h,約為對照水平的7倍。LCDV感染褐牙鲆后,IFN-1、IFN-γ、IRF-7和Mx基因在頭腎組織中均上調(diào)表達。IFN-I的表達量于感染后3天達到最高峰,為對照水平的48倍:IRF-7、IFN-γ和Mx基因的表達量均于感染后5天達到最高峰,分別為對照水平的14、25和80倍;IRF-3則組成型地表達于褐牙鲆的頭腎組織中,其表達水