1、副豬嗜血桿菌（haemophlius parasuis，HPS）屬巴氏桿菌科嗜血桿菌屬細(xì)菌，為革蘭氏陰性，小短桿至長絲狀，V因子依賴性非溶血性細(xì)菌，是豬上呼吸道的一種常在菌，在一定條件下可引起嚴(yán)重的全身性疾病，以纖維素性多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎為主要特征，該病原引起的疾病又稱為革拉氏?。℅lasser’s disease）。該菌多與其他病原如豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒等混合感染，嚴(yán)重危害了仔豬和青年豬的健康。近年來由于該病的

2、頻繁發(fā)生，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了嚴(yán)重的損失，因此倍受人們的關(guān)注。
　　 1.根據(jù)副豬嗜血桿菌16S rRNA基因設(shè)計(jì)了一對(duì)引物，通過最佳條件摸索擴(kuò)增出大小為821bp的特異的目的基因片段，建立了快速檢測副豬嗜血桿菌的PCR方法。該方法最低檢出量達(dá)10-3ng，且對(duì)大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、傳染性胸膜肺炎放線桿菌和豬多殺性巴氏桿菌等多種常見細(xì)菌均無交叉性反應(yīng)。門診送檢的病料中用該P(yáng)CR法檢測出4株副豬嗜血桿菌，并對(duì)分離株SH08-54

3、P的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序與比對(duì)分析，其與已發(fā)表的GenBank中的相關(guān)菌株的同源性為97.3％-100％。
　　 2.2008年2月至2009年5月間從來自于上海地區(qū)規(guī)?；B(yǎng)殖場、屠宰場和上海市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心門診的1518份樣品中，結(jié)合臨床特征、HPS的培養(yǎng)特性及形態(tài)、染色情況等對(duì)其進(jìn)行了初步鑒定，初步分離了38株副豬嗜血桿菌疑似株。根據(jù)HPS16S rRNA基因設(shè)計(jì)合成引物建立特異PCR方法并結(jié)合生化特性試驗(yàn)從38份樣

4、品中分離到24株HPS，總分離率為1.6％（24/1518），細(xì)菌來源主要為上海市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心門診采集的臨床樣品，占70.8％（17/24），其余為豬場日常監(jiān)測的咽喉拭子及屠宰場豬肺、心等樣品。生化試驗(yàn)結(jié)果表明，分離株與參考菌株均表現(xiàn)為吲哚、脲酶、山梨糖和甘露醇陰性，葡萄糖、麥芽糖和半乳糖陽性。并對(duì)這24株HPS進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明所有分離株對(duì)阿奇霉素、頭孢拉定、菌必治、先鋒必、氧氟沙星和呋喃妥因較為敏感，然而已經(jīng)對(duì)新生霉素、

5、阿米卡星、林可霉素、紅霉素和慶大霉素等多種抗生素產(chǎn)生了嚴(yán)重的耐藥性，并且有加強(qiáng)的趨勢，提醒人們對(duì)濫用抗生素所帶來的隱患應(yīng)予足夠重視。血清學(xué)分型顯示分離株以血清5型和血清4型最為流行，所占比例分別為29.2％（7/24）和16.7％（4/24），其次為血清12、13和14型，其中4株分離株不能進(jìn)行分型。
　　 3.利用稀有限制性位點(diǎn)聚合酶鏈反應(yīng)（IRS-PCR）對(duì)34株副豬嗜血桿菌進(jìn)行基因分型研究，擴(kuò)增出分子量在100-2000b

6、p之間的7-18條清晰的條帶，34株菌被成功分為Ⅰ和Ⅱ大類群。10株參考菌株中有8株和1/3的分離株屬Ⅰ類群，HS80，HS1075和2/3的分離株屬于Ⅱ類群，其中來自于南匯，奉賢和嘉定的所有分離株均屬Ⅱ類群，且同源性較高，遺傳相關(guān)系數(shù)大于0.60。IRS-PCR敏感性和穩(wěn)定性好，具省時(shí)省力等優(yōu)勢，是理想的副豬嗜血桿菌基因分型方法。
　　 4.選擇Sau3AI對(duì)HPS上海流行優(yōu)勢菌株SH08-54P不完全酶切獲取1-6kb的DN

7、A片段，以pUC18質(zhì)粒DNA為載體，用BamHI完全酶切、CIAP處理后與上述DNA片段連接構(gòu)建基因組文庫，獲得3.89×105個(gè)重組克隆子，符合建庫要求，隨機(jī)挑取24個(gè)克隆子經(jīng)PCR鑒定重組率為100％，且插入1kbDNA片段比例為92％，文庫構(gòu)建成功；利用超聲波裂解菌液與佐劑混合免疫SPF新西蘭大白兔制備抗血清，對(duì)用IPTG誘導(dǎo)后的文庫進(jìn)行反復(fù)3次免疫篩選，最終獲得5個(gè)持續(xù)陽性克隆子，片段大小分別大約為0.7 kb，1.0 kb，