1、在家禽生產(chǎn)中，據(jù)不完全統(tǒng)計，每年有5-12％的種公雞因產(chǎn)精能力低下遭到淘汰。中國的大部分地方雞品種更是存在繁殖效率低下的顯著弱點，其公母配比高于專門化高產(chǎn)品種一倍以上，是產(chǎn)業(yè)化程度不高，良種繁育體系不健全的重要原因之一。為了探究公雞弱精癥的發(fā)病機理，本課題前期應(yīng)用數(shù)字基因表達譜技術(shù)(Digital Gene Expression，DGE)構(gòu)建了無精癥公雞與正常公雞的睪丸差異表達基因數(shù)據(jù)庫。本研究用生物信息學(xué)方法重新分析DGE數(shù)據(jù)庫，挑選

2、了與公雞弱精癥相關(guān)的6個候選基因(COX7B、PTGDS、hPGDS、SPA G6、WNT2、CCNF)，從300只42周齡的北京油雞種公雞的大群體中，進行了為期4周的精液品質(zhì)檢測，篩出弱精及正常個體各15只。采用RT-qPCR對這6個候選基因在兩組個體的睪丸組織中的表達量進行了相對定量檢測，來驗證DGE結(jié)果的可靠性。從驗證的差異表達基因中挑選了CCNF(cyclin F)，同時以雞精原干細(xì)胞-SSCs、睪丸支持細(xì)胞、DF1細(xì)胞為實驗?zāi)?/p>

3、型，進行了三種細(xì)胞CCNF基因表達量的檢測;采用RNAi技術(shù)，構(gòu)建的4條慢病毒靶向干擾載體在三種細(xì)胞上做了轉(zhuǎn)染效率和干擾效率的檢測，篩選出最佳轉(zhuǎn)染效率時病毒滴度/MOI值和最優(yōu)干擾序列，應(yīng)用RT-qPCR技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后24 h、48 h、72 h、96 h模式細(xì)胞中CCNF基因的mRNA水平的表達量;用CCK8法檢測慢病毒載體siR-1侵染后模式細(xì)胞在不同時間點細(xì)胞周期的變化，為探索公雞弱精癥的發(fā)病機理的深入研究和最終尋找到致病潛在標(biāo)志

4、物做了基礎(chǔ)鋪墊。
　　結(jié)果表明:
　　1.RT-qPCR對DGE中挑選的與弱精相關(guān)的6個候選基因的定量結(jié)果發(fā)現(xiàn)，COX7B、PTGDS在弱精組個體睪丸的表達量顯著高于正常個體(P＜0.01)，WNT2、hPGDS、CCNF在弱精組個體的表達量顯著低于正常個體(P＜0.05)，SPAG6在兩組睪丸中的表達量沒有顯著差異，該結(jié)果與DGE的結(jié)果相吻合，說明DGE結(jié)果可靠，確立了COX7B、PTGDS、WNT2、hPGDS、CCNF

5、這5個基因可作為公雞弱精癥的重要候選基因。
　　2.從前期初步驗證的候選基因中挑選了CCNF基因，SSCs、睪丸支持細(xì)胞、DF1細(xì)胞的定量檢測結(jié)果顯示CCNF在這三種細(xì)胞的表達量相當(dāng)，說明CCNF基因具有廣泛表達特性。
　　3.在三種模式細(xì)胞上的轉(zhuǎn)染效率檢測和干擾載體的篩選結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)病毒液與培養(yǎng)基以1∶19即滴度為5×106 TU/mL、MOI=5，此條件下的慢病毒液侵染DF1和支持細(xì)胞效率可達60％，而在SSCs上的轉(zhuǎn)染

6、效率只有20％，說明慢病毒載體對SSCs侵染效果不佳。進而在DF1和支持細(xì)胞上的CCNF靶向siRNA干擾的定量檢測結(jié)果顯示siR-1轉(zhuǎn)染兩種細(xì)胞后在72 h和96hCCNF基因表達量極顯著下調(diào)(P＜0.01)，說明構(gòu)建的干擾載體能有效沉默這兩種細(xì)胞中CCNF基因的表達。
　　4.在兩種細(xì)胞上四個時間點CCK8檢測細(xì)胞活力的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，空白組和陰性對照組細(xì)胞活力均沒有明顯變化;與空白組相比，在siR-1干擾的支持細(xì)胞中，72 h和9