1、CREB（cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白）/ATF（激活轉(zhuǎn)錄因子）家族是真核生物中廣泛存在的一類基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子，該家族共同的結(jié)構(gòu)特征是堿性亮氨酸拉鏈（bZIP）模體。CREB/ATF家族蛋白涉及到細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、胞外刺激和應(yīng)激反應(yīng)等細(xì)胞生命過程。CREB2、CREB3和CREB3L4是ATF/CREB家族中三個(gè)重要的成員。
　　 本文以梅山豬為研究對(duì)象，首次對(duì)豬CREB家族的這三個(gè)基因及CREB3L4的剪接體進(jìn)行了基因克隆，通過

2、PCR擴(kuò)增獲取基因組序列并對(duì)其進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析，利用輻射雜種細(xì)胞板技術(shù)和半定量RT-PCR等方法進(jìn)行了基因的染色體定位和組織表達(dá)分析：另外還克隆豬CREB3啟動(dòng)子區(qū)域并構(gòu)建了pGL3熒光素酶報(bào)告載體，利用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)脂多糖刺激后CREB3 mRNA相對(duì)表達(dá)量，并利用雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒檢測(cè)脂多糖刺激后CREB3的啟動(dòng)子活性是否變化。研究結(jié)果如下：
　　 1．?dāng)U增得到豬CREB家族三個(gè)成員的的cDNA序列，包含全長(zhǎng)編碼區(qū)

3、及部分非編碼區(qū)，并對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)的分析。其中CREB2編碼區(qū)為1047 bp，編碼378個(gè)氨基酸； CREB3編碼區(qū)為1098 bp，編碼375個(gè)氨基酸； CREB3L4 varant1和varant2編碼區(qū)分別為1188bp和816bp，分別編碼395和271個(gè)氨基酸。在蛋白質(zhì)水平上，CREB2與人、小鼠CREB2分別享有85.8％，71.7％的相似性；CREB3與人、小鼠CREB3分別享有72.6％和65.0％的相似性；CRE

4、B3L4與人、小鼠CREB3L4分別享有82.5％和61.1％的相似性。
　　 2．?dāng)U增獲得CREB家族這三個(gè)成員的基因組序列并分析它們的基因結(jié)構(gòu)。CREB2基因組長(zhǎng)度為2069bp，包含三個(gè)外顯子和兩個(gè)內(nèi)含子；CREB3基因組長(zhǎng)度大約為5.3kb，包含九個(gè)外顯子和八個(gè)內(nèi)含子；CREB3L4基因組長(zhǎng)度大約為6.3kb，包含十個(gè)外顯子和九個(gè)內(nèi)含子。這三個(gè)基因所有的外顯子和內(nèi)含子的交界都符合GT/AG法則。根據(jù)所得到的基因組序列，利

5、用輻射雜種板技術(shù)將CREB2、CREB3和CREB3L4分別定位在5p、1q28和4q。并且通過比對(duì)豬-人比較基因組圖譜證實(shí)這兩個(gè)基因的定位結(jié)果與人相應(yīng)基因在染色體上的位置相對(duì)應(yīng)。
　　 3．以梅山豬的脂肪組織、骨骼肌、心、胃、肝、肺、脾、腸、腦、腎、淋巴等十一個(gè)組織樣品為材料，利用半定量RT-PCR的方法研究了CREB家族這三個(gè)成員在mRNA水平上的組織表達(dá)譜。結(jié)果表明CREB2、CREB3和CEEB3L4在組織中廣譜性表達(dá)。

6、CREB2和CREB3均在白色脂肪組織、胃、腎肺、小腦、肝臟和淋巴幾個(gè)組織中高表達(dá)。CEEB3L4 variant1在肝臟和胃中表達(dá)量較高，中度表達(dá)與小腦中，其次是脾、白色脂肪組織和淋巴組織，然而在骨骼肌和腎中表達(dá)量極低。另外，與CEEB3L4 variant1相比，CEEB3L4 variant2普遍在組織中以極低的水平表達(dá)，說明CEEB3L4 variant1是組織中CEEB3L4存在的主要形式。
　　 4．為了研究CREB

7、3的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，我們克隆得到CREB35’端上游區(qū)域啟動(dòng)子區(qū)域1926bp，并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)分析，發(fā)現(xiàn)在GC box元件上游有4個(gè)SP1識(shí)別位點(diǎn)、1個(gè)NF-κB位點(diǎn)、2個(gè)AP1位點(diǎn)和1個(gè)AP2位點(diǎn)。進(jìn)而構(gòu)建插入了此段區(qū)域的熒光素酶報(bào)告載體，檢測(cè)到此段區(qū)域具有較強(qiáng)的啟動(dòng)子活性。
　　 5．用濃度為1μg/ml的脂多糖（LPS）分別刺激豬IBRS-2和小鼠RAW263.7細(xì)胞，使用qRT-PCR方法檢測(cè)CREB3的表達(dá)變化。