1、花生是世界四大油料作物之一，中國(guó)是世界上花生生產(chǎn)和消費(fèi)最多的國(guó)家。花生功能基因研究，種子是關(guān)鍵對(duì)象：花生胚胎早期發(fā)育是花生產(chǎn)量和品質(zhì)形成的重要時(shí)期。南方沙質(zhì)旱地土壤地區(qū)花生常因缺鈣而嚴(yán)重空莢或不飽滿，導(dǎo)致花生減產(chǎn)降質(zhì)。為揭示花生胚發(fā)育的功能基因組，同時(shí)揭示缺鈣使花生胚敗育的分子機(jī)理，本研究在平潭縣典型缺鈣地，設(shè)足鈣與缺鈣處理使花生幼胚向可育與敗育方向發(fā)展，在對(duì)缺、足鈣條件下花生形態(tài)及相關(guān)生物學(xué)性狀差異觀察的基礎(chǔ)上，分別構(gòu)建了缺、足鈣條件

2、下花生早期胚正反向抑制消減雜交文庫(kù)和混合全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)。對(duì)全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)進(jìn)行了初步EST測(cè)序與基因注釋和功能分類，并對(duì)缺鈣花生早期胚SSH文庫(kù)進(jìn)行了初步篩選，對(duì)篩選的差異基因進(jìn)行了半定量RT-PCR初步鑒定。主要研究結(jié)果如下。 (1)于結(jié)莢期對(duì)缺、足鈣條件下花生幼胚發(fā)育進(jìn)行了剝胚觀察，于收獲期對(duì)缺、足鈣條件下花生植株進(jìn)行形態(tài)觀察，并對(duì)相關(guān)生物學(xué)性狀進(jìn)行了考查。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，缺鈣條件下花生生長(zhǎng)后期植株比足鈣條件下更加旺盛，莖部呈現(xiàn)

3、暗紫色，多數(shù)表現(xiàn)為空莢或者爛果；足鈣花生因后期營(yíng)養(yǎng)較多分配到莢果，表現(xiàn)地上部生長(zhǎng)較差，但莢果飽滿，飽果數(shù)多。對(duì)花生早期胚敗育的分子機(jī)理與防治對(duì)策進(jìn)行了探討，為指導(dǎo)生產(chǎn)實(shí)踐提供參考。 (2)利用抑制消減雜交技術(shù)成功構(gòu)建了缺、足鈣條件下花生早期胚正反向抑制消減雜交文庫(kù)，缺、足鈣初級(jí)文庫(kù)分別包含有1.2×106和1.4×106個(gè)克隆。所長(zhǎng)出的菌落中分別有93.2％和91.2％為白色克隆，經(jīng)菌落PCR鑒定，發(fā)現(xiàn)其中單一擴(kuò)增條帶的克隆分別

4、約占85.3％和86.9％，片段大小集中分布在200～800bp之間。 (3)利用SMART技術(shù)成功構(gòu)建了缺、足鈣花生早期胚混合全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)。初級(jí)文庫(kù)的滴度為1.867×106cfu/ml，重組率為95.8％，插入片段分布于500bp-2000bp之間，擴(kuò)增文庫(kù)的滴度約為9.68×1011 cfu/ml。從文庫(kù)中隨機(jī)挑選20個(gè)單克隆，進(jìn)行兩端測(cè)序，結(jié)果表明全長(zhǎng)率為45％，文庫(kù)質(zhì)量符合標(biāo)準(zhǔn)要求。從文庫(kù)中隨機(jī)挑取298個(gè)單克隆進(jìn)

5、行5’端測(cè)序，共得到288條EST序列，平均片段大小為671bp，其中有46條EST在NCBI上沒有找到同源序列，242條EST中，主要與大豆、截型苜蓿、花生、百脈根、擬南芥等植物同源，僅有21.9％的EST序列與NCBI非冗余核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知功能基因有較高的同源性，未知功能的EST占78.1％，在已知功能的53條EST中，主要涉及蛋白質(zhì)合成加工及儲(chǔ)藏基因、代謝相關(guān)基因、抗病與防御相關(guān)基因、轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞生長(zhǎng)/分化相關(guān)基因、細(xì)胞結(jié)構(gòu)

6、相關(guān)基因等。 (4)利用菌落雜交的方法，分別以地高辛標(biāo)記的缺、足鈣花生早期胚cDNA為探針，與缺鈣花生早期胚抑制消減雜交文庫(kù)進(jìn)行菌落雜交，初步篩選到14個(gè)差異表達(dá)基因，并對(duì)SSHQ-1，SSHQ-12，SSHQ-13，SSHQ-14進(jìn)行了初步RT-PCR鑒定。結(jié)果表明，基因SSHQ-1和SSHQ-12都在缺鈣花生早期胚中表達(dá)，而在足鈣花生早期胚中沒有表達(dá)，SSHQ-13在缺鈣花生早期胚中的表達(dá)量明顯高于在足鈣花生早期胚中的表達(dá)量