1、類(lèi)病毒是能夠侵染多種植物并造成重大經(jīng)濟(jì)損失的RNA分子。類(lèi)病毒由于特有的基因序列和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，提供寄主.病原相互作用的一個(gè)最佳的研究模式。RNA沉默是植物和其它真核生物用來(lái)防御外來(lái)核酸侵染的一種保守的防御機(jī)制。在病毒誘導(dǎo)的基因沉默途徑（Virusinducing gene silencing，VIGS）中，21～24 nt病毒小分子RNAs（vsiRNA）的產(chǎn)生是植物抗病毒RNA沉默誘發(fā)的標(biāo)志。目前對(duì)于vsiRNA生物合成的機(jī)制及其生物學(xué)

2、功能的還沒(méi)有完全研究清楚。與之相對(duì)應(yīng)，很多病毒通過(guò)編碼RNA沉默抑制子蛋白或直接以病毒RNA來(lái)拮抗植物的抗病毒RNA沉默。植物在受到類(lèi)病毒侵染后同樣會(huì)啟動(dòng)VIGS途徑產(chǎn)生類(lèi)病毒專(zhuān)化性的小RNA，然而，裸露的類(lèi)病毒非編碼RNAs如何能逃脫細(xì)胞內(nèi)的抗病毒RNA沉默呢?
　　 本研究針對(duì)在我國(guó)馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)黑龍江省采集的馬鈴薯紡錘塊莖類(lèi)病毒（Potato spindletuber viroid，PSTVd）樣品，進(jìn)行基因克隆和序列分析，

3、開(kāi)展PSTVd遺傳變異多樣性的研究。同時(shí)，以PSTVd為研究對(duì)象，利用分子生物學(xué)技術(shù)，深入研究PSTVd侵染植物后誘導(dǎo)的基因沉默，了解類(lèi)病毒是否也會(huì)象病毒那樣，對(duì)寄主的防御系統(tǒng)產(chǎn)生沉默抑制功能，從而實(shí)現(xiàn)其侵染目的。同時(shí)，還研究在沉默過(guò)程中所產(chǎn)生的siPSTVd的生物合成機(jī)制及其是否對(duì)植物體內(nèi)的miRNA合成途徑有所影響。研究結(jié)果如下：
　　 1、類(lèi)病毒具有遺傳變異多樣性，其在寄主體內(nèi)以相近變異群體進(jìn)行傳播。
　　 對(duì)克山

4、馬鈴薯所提供的PSTVd陽(yáng)性試管苗樣品PKS1-6進(jìn)行序列測(cè)定，結(jié)果顯示其序列與已報(bào)道的強(qiáng)株系（KF440-2、RG1）與中間株系（PSTVd int）有較大的序列差異，同源性?xún)H為97.21％、97.77％和98.61％，而與所報(bào)道的弱株系KF-5、GI333357和GBX76844同源性較大，分別為99.16％、99.72％和99.44％。因此，從序列上看PKS1-6更接近于弱株系。用PKS1-6分離物接種轉(zhuǎn)GFP基因煙草16C，對(duì)侵

5、染后陽(yáng)性樣品的PSTVd進(jìn)行序列測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在4個(gè)測(cè)定序列中，有3個(gè)類(lèi)病毒序列與接種的PSTVd序列相比發(fā)生了變異，變異部位在中央保守區(qū)有3處（81、82和267位），在可變區(qū)有2處（127和136位），致病區(qū)有1處（56位）。說(shuō)明，類(lèi)病毒序列有一定保守性和可變性，其變異可能受環(huán)境條件、寄主范圍等因素影響，其變化也不僅僅局限在可變區(qū)（V區(qū)）。對(duì)于采自富錦的田間PSTVd一份陽(yáng)性樣品進(jìn)行序列分析，在6個(gè)克隆中，有5個(gè)與PKS1-6序列同

6、源，只有一個(gè)PFJ-14有2個(gè)突變，發(fā)生在左末端區(qū)（40位）和致病區(qū)（296位）。對(duì)于采自泰康的一份陽(yáng)性田間樣品，對(duì)其11個(gè)克隆進(jìn)行序列測(cè)定，有4個(gè)與PKS1-6同源，有7個(gè)發(fā)生了變異。
　　 研究中共對(duì)來(lái)自克山馬鈴薯所和采自富錦、泰康馬鈴薯田的PSTVd陽(yáng)性樣品的22個(gè)PSTVd克隆進(jìn)行序列測(cè)定，共產(chǎn)生12個(gè)不同序列，其中與PKS1-6分離物序列相同的變異物有10個(gè)，其核苷酸差異數(shù)量在0～3個(gè)之間，同源性在99.16％～100

7、％。二級(jí)結(jié)構(gòu)的最低自由能變化為-159.10～-173.60 kcal/mol。其序列變異主要分布在CCR區(qū)和可變區(qū)，變異頻率分別為38.1％和28.9％。其次為致病區(qū)（變異頻率為14.3％）和左、右末端區(qū)（變異頻率均為9.5％）。
　　 2、類(lèi)病毒能誘導(dǎo)寄主產(chǎn)生沉默，但不具有沉默抑制子功能。
　　 利用我們構(gòu)建的含有類(lèi)病毒正負(fù)鏈單體和雙體的植物表達(dá)載體分別與含報(bào)道基因GFP載體的農(nóng)桿菌共注射轉(zhuǎn)GFP基因煙草16C，發(fā)現(xiàn)

8、與類(lèi)病毒共注射的葉片的熒光弱于對(duì)照，表明類(lèi)病毒可能在一定程度上促進(jìn)了GFP的沉默。對(duì)PSTVd和GFP的序列進(jìn)行比對(duì)，其同源性?xún)H為47.6％（Identity），最長(zhǎng)的同源區(qū)域（Longest identitied seq）僅為9 bp，不具有產(chǎn)生沉默的條件。為了排除類(lèi)病毒載體對(duì)共注射的GFP載體中的35S啟動(dòng)子產(chǎn)生沉默，又利用含有pdsi的發(fā)夾載體與類(lèi)病毒載體共注射煙草葉片，觀察葉片白化現(xiàn)象。結(jié)果，類(lèi)病毒還是促進(jìn)了煙草PDS基因的沉默

9、。但Northern blot雜交結(jié)果表明35S啟動(dòng)子來(lái)源的siRNA積累水平與空載體對(duì)照沒(méi)有明顯差異，表明類(lèi)病毒促進(jìn)的沉默不是在啟動(dòng)子上。同時(shí)，對(duì)GFP和PSTVd共注射的樣品進(jìn)行mGFP的Nothern blot雜交，結(jié)果顯示，GFP和PSTVd共注射的mGFP的量少于GFP與空載體共注射的量。說(shuō)明，在mGFP的轉(zhuǎn)錄水平上，受共注射的PSTVd的影響，GFP mRNA的積累量減少，從而熒光減弱。通過(guò)這些結(jié)果我們推斷，類(lèi)病毒促進(jìn)的基因

10、沉默可能與甲基化有關(guān)，可能發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平上。
　　 3、類(lèi)病毒產(chǎn)生的siPSTVd來(lái)源于成熟的二級(jí)結(jié)構(gòu)。
　　 通過(guò)對(duì)含有PSTVd可復(fù)制的雙體負(fù)鏈載體和非全長(zhǎng)不可復(fù)制的載體注射煙草后的siPSTVd的檢測(cè)結(jié)果顯示，均檢測(cè)到了特異性的siPSTVd，說(shuō)明除了復(fù)制形成的dsRNA這一來(lái)源外，PSTVd形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)也是產(chǎn)生siPSTVd的重要來(lái)源。從誘發(fā)產(chǎn)生siRNA的數(shù)量比例上看，其中數(shù)量比例較多的是（+）siRNAs。

11、這個(gè)觀察結(jié)果與PSTVd RNA基因組折疊成高度結(jié)構(gòu)化二級(jí)結(jié)構(gòu)，然后在體內(nèi)被.DCL切割的理論相一致。
　　 4、類(lèi)病毒侵染產(chǎn)生的siPSTVd沒(méi)有調(diào)控內(nèi)源的miRNA途徑。
　　 對(duì)于接種番茄（Rutgers）和馬鈴薯的陽(yáng)性樣品和對(duì)照陰性樣品雜交結(jié)果顯示：陽(yáng)性樣品均檢測(cè)到siPSTVd（±），證明類(lèi)病毒侵染番茄和馬鈴薯后，誘導(dǎo)寄主產(chǎn)生基因沉默現(xiàn)象。而沒(méi)有接種類(lèi)病毒的番茄和馬鈴薯，沒(méi)有檢測(cè)到siPSTVd（±）。對(duì)同一張

12、膜，同時(shí)檢測(cè)了mi159和mi167，結(jié)果顯示，受類(lèi)病毒侵染的馬鈴薯和番茄植株與健康植株相比，miRNA積累水平無(wú)明顯變化，煙草植株之間的miRNA的積累水平也沒(méi)有明顯變化，表明類(lèi)病毒的入侵對(duì)植物體內(nèi)的miRNA途徑影響不大，至少對(duì)兩個(gè)主要miRNA（mi159和mi167）產(chǎn)生途徑?jīng)]有影響。
　　 研究類(lèi)病毒侵染植物的策略有助于揭示基礎(chǔ)的分子生物和細(xì)胞加工的機(jī)理，對(duì)于植物和其它有機(jī)物細(xì)胞和分子生物學(xué)的整體產(chǎn)生重要影響。通過(guò)對(duì)這