1、OsRacD是水稻小GTP結(jié)合蛋白R(shí)op(Rho of plant)基因家族的一個(gè)新成員，前期工作已經(jīng)證實(shí)該基因的功能之一是調(diào)控花粉管的延伸生長(zhǎng)，參與光敏核不育水稻農(nóng)墾58S光周期育性轉(zhuǎn)換過(guò)程，是水稻光信號(hào)通路中的一個(gè)關(guān)鍵的“開(kāi)關(guān)分子”。為研究OsRacD相關(guān)信號(hào)通路及調(diào)控機(jī)制，本研究根據(jù)生物信息學(xué)分析的提示，采用PCR方法，在該基因的GTP結(jié)合域引入T20N點(diǎn)突變(由蘇氨酸突變?yōu)樘於０?，并借助分子生物學(xué)，生化和細(xì)胞學(xué)方法，研究了該

2、突變對(duì)蛋白生化活性，蛋白質(zhì)相互作用，亞細(xì)胞定位的影響，為深入解析OsRacD的功能和調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。 利用網(wǎng)絡(luò)工具以及生物軟件對(duì)OsRacD和T20N-OsRacD進(jìn)行了預(yù)測(cè)和分析，包括蛋白翻譯后修飾位點(diǎn)，保守結(jié)構(gòu)域以及三維結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，T20N點(diǎn)突變的引入使OsRacD蛋白的GTP結(jié)合位點(diǎn)消失，同時(shí)蛋白在三維結(jié)構(gòu)也發(fā)生了一些變化，主要表現(xiàn)在η1螺旋結(jié)構(gòu)和β1折疊片結(jié)構(gòu)上。 通過(guò)對(duì)蛋白的保守結(jié)構(gòu)域分析，采用重疊延伸

3、PCR方法在OsRacD基因的第一個(gè)高度保守的基序G1區(qū)引入T20N點(diǎn)突變，進(jìn)一步構(gòu)建了與His6融合的原核表達(dá)載體pET28(a)-T20N-OsRacD，并原核表達(dá)和純化了T20N-OsRacD蛋白，利用組氨酸標(biāo)簽抗體，通過(guò)Western blot證實(shí)了融合蛋白表達(dá)和純化的正確性。 純化T20N-OsRacD蛋白的GTP水解活性分析顯示，與野生型OsRacD蛋白相比，T20N-OsRacD蛋白內(nèi)在的GTP酶活性進(jìn)一步降低，提

4、示突變后的OsRacD蛋白處于失活形式，同時(shí)也證明第20位的蘇氨酸與蛋白的GTP酶活性關(guān)系密切。酵母雙雜交體系蛋白互作檢測(cè)顯示，與野生型OsRacD蛋白相比，T20N-OsRacD喪失了與OsRhoGDI1和OsRhoGDI2結(jié)合的特點(diǎn)，提示T20N點(diǎn)突變影響了OsRacD與其活性調(diào)控蛋白的結(jié)合。 為研究點(diǎn)突變對(duì)OsRacD蛋白亞細(xì)胞定位的影響，分別將綠色熒光蛋白與野生型和突變型OsRacD融合，進(jìn)而構(gòu)建了受控于CaMV35S啟

5、動(dòng)子的雙元植物表達(dá)載體，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化到洋蔥表皮細(xì)胞中。熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示，野生型OsRacD蛋白在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜都有分布，而突變型的T20N-OsRacD蛋白則大都集中到細(xì)胞核周?chē)?，說(shuō)明T20N-OsRacD在活細(xì)胞內(nèi)處于未活化的狀態(tài)。 本研究證實(shí)T20N點(diǎn)突變可以模擬OsRacD的失活形式，該突變不僅體現(xiàn)在對(duì)蛋白生化活性，與調(diào)控蛋白的相互作用的影響上，而且使蛋白的亞細(xì)胞定位也發(fā)生變化，為研究OsRacD在水稻光信號(hào)