1、為克隆Avr-Pil、Avr-Pi2和Avr-Pi4α，利用與稻瘟病菌81278菌株中的無(wú)毒基因簇緊密連鎖的分子標(biāo)記SC1088篩選81278的BAC文庫(kù)，共得到4個(gè)陽(yáng)性BAC克隆子(805L15、807P11、809L6和811C13)。本研究首先對(duì)其中的3個(gè)陽(yáng)性BAC克隆子進(jìn)行亞克隆，并挑選部分亞克隆子進(jìn)行測(cè)序。根據(jù)獲得的序列，登錄稻瘟病菌基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列比對(duì)，結(jié)果得出陽(yáng)性BAC克隆子805L15中不同區(qū)段的序列分別與稻瘟病菌數(shù)

2、據(jù)庫(kù)不同的Supercontig中的相應(yīng)序列同源。同樣，807P11與809L6中的不同區(qū)段序列也存在類(lèi)似情況。根據(jù)亞克隆子序列開(kāi)發(fā)了一個(gè)多態(tài)性標(biāo)記P807-11，該標(biāo)記與無(wú)毒基因簇緊密連鎖，與Avr-Pil、Avr-Pi2和Avr-Pi4α的遺傳距離分別為43.2 cM、50.0 cM和33.8 cM。 根據(jù)遺傳圖譜，81278的無(wú)毒基因簇位于分子標(biāo)記P807-11和BAC809L6之間，而標(biāo)記P807-11和BAC809L6

3、均在BAC805L15上。因此選擇了805L15進(jìn)行BAC測(cè)序。根據(jù)805L15的序列開(kāi)發(fā)了與無(wú)毒基因簇緊密連鎖的5個(gè)多態(tài)性標(biāo)記(L230、L891-2、L469-1、L469-3、L213-1)和1個(gè)SSR標(biāo)記(S85-1)。構(gòu)建包含這些標(biāo)記與無(wú)毒基因簇的遺傳連鎖圖譜，得出Avr-Pil位于無(wú)毒基因簇中間；標(biāo)記L469-1、BAC809L6和L213-1位于無(wú)毒基因簇Avr-Pi2一側(cè)，其中L213-1與無(wú)毒基因簇的遺傳距離最近，與無(wú)

4、毒基因族的遺傳距離10.2 cM；標(biāo)記L230、L469-3、S85-1和P807-11位于無(wú)毒基因簇Avr-Pi4α一側(cè)，其中L230與無(wú)毒基因簇的遺傳距離最近，與無(wú)毒基因族的遺傳距離為15.4cM；標(biāo)記L891-2位于無(wú)毒基因簇里，介于Avr-Pil和Avr-Pi2之間，與Avr-Pil Avr-Pi2和Avr-Pi4α的遺傳距離分別為9.5 cM、9.5 cM和11.4 cM。說(shuō)明無(wú)毒基因簇位于標(biāo)記L213-1和L230之間，遺傳

5、距離跨越46.2 cM。這進(jìn)一步確定81278的無(wú)毒基因簇在805L15上，且位于805L15的T7端和標(biāo)記L230-1之間。 利用生物信息學(xué)軟件對(duì)805L15序列進(jìn)行基因預(yù)測(cè)，共預(yù)測(cè)到48個(gè)基因，且在48個(gè)基因中預(yù)測(cè)到8個(gè)胞外分泌蛋白和一個(gè)GPI信號(hào)錨定蛋白。 構(gòu)建了預(yù)測(cè)信號(hào)肽的互補(bǔ)載體SP1-pCX62、SP4-pCX62、SP5-pCX62、SP6-pCX62和SCP9-pCX62。用酵母同源重組的方法構(gòu)建了預(yù)測(cè)信

6、號(hào)肽的過(guò)表達(dá)載體SP1-pDL1、SP4-pDL1、SP5-pDL1、SP6-pDL1、SP7-pDL1和SP8-pDL1。構(gòu)建了805L15的cosmid文庫(kù)，得到9個(gè)不同的克隆子(SwaⅠ-2、SwaⅠ-4、SwaⅠ-7、SwaⅠ-8、SwaⅠ-10、NotⅠ-1、SgrAⅠ-2、FseⅠ-2和FseⅠ-3)。上述質(zhì)粒均轉(zhuǎn)化毒性親本菌株GUY11原生質(zhì)體，除SwaⅠ-2沒(méi)有得到轉(zhuǎn)化子外，其余的質(zhì)粒都得到有潮霉素抗性的轉(zhuǎn)化子。具有潮霉