1、蘭科植物(Orchidaceae)為不易鑒別的植物類群,特別是在非生育期,許多種類間的植株形態(tài)差別細(xì)微,難于用傳統(tǒng)分類法區(qū)別開(kāi)來(lái)。不少蘭科植物容易自然雜交,中間類型多,變異較大,其分類界限不是很明確,給屬間、屬內(nèi)種的分類和整理帶來(lái)了很大的困難。DNA條形碼技術(shù)利用DNA片段快速鑒別物種,是分類學(xué)中輔助物種鑒定的新技術(shù),是目前分子生物學(xué)和分類學(xué)發(fā)展的最新方向。
　　 本研究以158份海南野生蘭植物為研究材料,運(yùn)用葉綠體matK基因

2、和核糖體ITS序列兩個(gè)片段作為海南野生蘭科植物DNA條形碼進(jìn)行區(qū)分和鑒定,主要結(jié)果如下:
　　 (1)matK基因和ITS序列達(dá)到理想的DNA條形碼候補(bǔ)片段的要求,可用作海南野生蘭科植物DNA條形碼的研究。研究表明,mark基因有效長(zhǎng)度在800bp左右,ITS序列為600bp左右,其長(zhǎng)度符合作為DNA條形碼的要求。matK基因和ITS序列均有較多的信息位點(diǎn)數(shù),分別為320bp和434bp,包含足夠的生物信息。在供試的有效材料中,

3、單獨(dú)使用marK基因和ITS序列的鑒別效力分別達(dá)到96.90％和81.08％。
　　 (2)構(gòu)建了基于matK基因和ITS序列的海南野生蘭科植物DNA條形碼的技術(shù)體系。利用引物marK4(390f/1326r)和ITS2(AB101f/AB102r),通過(guò)對(duì)PCR反應(yīng)的優(yōu)化研究,結(jié)果表明通過(guò)向反應(yīng)體系添加增強(qiáng)子可解決ITS擴(kuò)增難的問(wèn)題,在供試的158份材料中ITS和matK均得到100％的擴(kuò)增;通過(guò)探討,選用K2P遺傳距離分析、

4、Wilconxon秩和檢驗(yàn)及NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析,集成DNA條形碼分析方法。
　　 (3)建立一種廣譜、簡(jiǎn)便和微量的蘭科植物基因組DNA的提取方法-一改良的CTAB法(方法4)。對(duì)所有供試的150余種(涉及4個(gè)亞科,70個(gè)屬)蘭科植物進(jìn)行DNA提取,結(jié)果表明該法可高效除去野生蘭葉片中的酚類、多糖和蛋白質(zhì)等雜質(zhì),DNA大小約23kb,A260/A280在1.6-2.0之間,產(chǎn)量在158-508 ng/μl之間,能滿足后續(xù)研究的要求。

5、
　　 (4)基于葉綠體matK基因和核糖體ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),有效地對(duì)海南野生蘭科植物進(jìn)行輔助鑒定,具有較高的鑒定率。依據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)合現(xiàn)有的形態(tài)學(xué)資料,成功地將17個(gè)未識(shí)別種中的7個(gè)鑒定到種,10個(gè)鑒定到屬。
　　 (5)獲得海南野生蘭的145個(gè)matK基因序列和151個(gè)ITS序列,可用于海南野生蘭科植物DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)的構(gòu)建。其中,有102個(gè)種的mark基因序列和89個(gè)種的ITS序列在Genebank上未