1、雞的呼吸道感染在養(yǎng)雞生產實踐中是一類極為常見的疾病。感染病原包括病毒、細菌、霉形體以及其它致病因素。大多數(shù)情況下是幾種病原的混合感染或不同病原先后繼發(fā)感染，致使雛雞生長發(fā)育遲緩、成年雞產蛋下降，可引起各種日齡雞只的死亡。雞新城疫(Newcastle disease，ND)、雞傳染性支氣管炎(Infectious laryngotrache，IB)以及禽流感(Avian influenza，AI)的H5、H9亞型是一類在臨床上有相似呼吸道

2、癥狀的病毒性傳染病，均屬于RNA病毒，僅根據(jù)臨床癥狀和病理表現(xiàn)很難準確及時作出診斷。不同的病毒感染其后續(xù)的處置方案亦不相同，延誤診斷時間或誤診均能給養(yǎng)雞企業(yè)造成重大經濟損失。因此，本實驗擬建立ND-IB-AIH5-AIH94種禽類呼吸道病原的多重RT-PCR鑒別診斷方法，并對其特異性和敏感性進行檢測，為臨床上提供特異性強、敏感性高且省時省力的實驗室鑒別診斷方法，其主要試驗結果如下：
　　 1.4種禽類呼吸道病原擴增引物的設計和擴

3、增方法的建立
　　 根據(jù)NDV的F基因片段，IBV的N基因片段以及AIV的H5、H9亞型的HA基因片段設計引物，對四對引物分別進行梯度RT-PCR擴增，在此基礎上選擇合適的RT-PCR的退火溫度同時對四對引物分別進行引物濃度的優(yōu)化，確定普通RT-PCR的退火溫度為58℃，，引物濃度為別為0.32pmol/μL(NDV)、0.32 pmol/μL(IBV)、0.24pmol/μL(H5)、0.24pmol/μL(H9)。最后設計的

4、四對引物、優(yōu)化的退火溫度和引物濃度能夠通過普通RT-PCR技術特異性擴增NDV、IBV、AIV的H5、H9亞型的基因片段，所擴增片段長度分別為：520bp(NDV)、748bp(IBV)、151bp(H5)、266bp(H9)。
　　 2.4種禽類呼吸道病原多重RT-PCR條件的優(yōu)化
　　 在普通RT-PCR的基礎上對多重RT-PCR進行優(yōu)化，分別從引物濃度比、Taq酶濃度、Mg2+濃度、dNTP濃度、退火溫度這五個方面

5、進行優(yōu)化。優(yōu)化的結果為Mg2+濃度為3.0mM，dNTP濃度為0.09U/μl，退火溫度為58℃，引物濃度分別為0.32pmol/μL(NDV)、0.32 pmol/μL(IBV)、0.24pmol/μL(H5)、0.24pmol/μL(H9)，優(yōu)化后的結果能夠很好的鑒別診斷這四種病毒以及這四種病毒的混合感染。
　　 3.4種禽類呼吸道病原多重RT-PCR方法的建立和初步應用
　　 建立的每種引物均能從陽性材料中擴增出相