1、<p><b>　　畢業(yè)論文文獻綜述</b></p><p><b>　　生物技術</b></p><p>　　分子標記技術在水產(chǎn)動物表型性狀遺傳分析中的應用</p><p>　　摘要：綜述了DNA 分子標記技術的類型及代表性分子標記技術的基本原理和優(yōu)缺點。 隨著DNA 分子標記技術的發(fā)展, 其在動物遺傳上發(fā)揮了

2、重大作用, 使用DNA 分子標記可以觀察到整個基因組的遺傳多樣性。DNA 分子標記的應用使得人們對遺傳多樣性、近親繁殖、種類和品系鑒定以及遺傳連鎖圖譜建立的研究都取得了很大進展, 也加快了數(shù)量性狀位點( QTL) 基因的鑒定作為分子標記輔助選擇( MAS) 的研究。</p><p>　　關鍵字：分子標記 遺傳 技術 </p><p>　　近年來, 隨著生物技術的不斷發(fā)展, 誕生了一系列

3、DNA 分子標記技術, 如限制性片斷長度多態(tài)性( restriction fragment length polymorphism,簡稱RFLP) 、隨機擴增多態(tài)性DNA( randomamplified polymorphic DNA, 簡稱RAPD) 、擴增片斷長度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism, 簡稱AFLP) 、簡單序列長度多態(tài)性(simple sequence length

4、 polymorphism, 簡稱SSLP)、隨機擴增微衛(wèi)星多態(tài)性(Random amplified microsatillitepolymorphism, 簡稱RAMP) 、序列標簽位點( Sequence-tagged sites, 簡稱STS) 、DNA 擴增指紋(DNA amplified fingerprinting, DAF) 、擴增子長度多態(tài)性( amplicon length polymorphism, 簡稱ALP)、特

5、異擴增子多態(tài)性( Specific ampiliconpolymorph</p><p>　　1、分子標記技術的種類、基本原理及優(yōu)缺點</p><p><b>　　1.1 RFLP</b></p><p>　　RFLP 是Grodzicker 于1974 年創(chuàng)立的。該技術最早用于DNA 水平上的品種鑒定分析。其基本原理是首先利用特定的限制性內切

6、酶將生物基因組DNA 進行酶切, 獲得大小不等的DNA片斷, 然后通過凝膠電泳分析形成不同的條帶,最后經(jīng)Southern 雜交和放射自顯影, 即可揭示出DNA 的多態(tài)性。但是, 由于RFLP 的技術要求高,檢測時間長, 且成本較高, 使得大規(guī)模應用受到限制。</p><p><b>　　1.2 RAPD</b></p><p>　　RAPD 是1990 年由美國杜邦公

7、司科學家Williams 和加利福尼亞生物研究所的Welsh 等發(fā)明的一種分子標記技術。它是以基因組DNA 為模板, 以一個隨機的寡核苷酸序列作引物, 通過PCR 擴增, 產(chǎn)生不連續(xù)的DNA 產(chǎn)物, 用以檢測DNA 序列的多態(tài)性。它可以在對物種沒有任何分子生物學研究的情況下, 對其進行基因組指紋圖譜的構建。與RFLP 技術相比, 具有DNA 用量少、簡單快速、引物無種屬特異性和不使用放射性同位素等優(yōu)點。但是RAPD 技術也有以下不足之處

8、: ( 1) 穩(wěn)定性差, 結果重復性不好;( 2)RAPD 一般為顯性標記, 不能鑒定雜合子;( 3)RAPD 標記在基因組中分布不均勻, 每個標記提供的信息量較少。</p><p><b>　　1.3 AFLP</b></p><p>　　AFLP 是荷蘭Keygene 公司Zabeau 等發(fā)明的一種DNA 分子標記技術。其基本原理是選擇性擴增基因組DNA 的酶切片

9、段, 由于不同材料的DNA 酶切片段存在差異, 因而便產(chǎn)生了擴增產(chǎn)物的多態(tài)性。選擇性擴增是通過在引物3’端加上選擇性核苷酸而這現(xiàn)的, 改變選擇性核苷酸的數(shù)目, 就可以預先決定所要擴增的片段的數(shù)目。研究表明, AFLP 產(chǎn)生的多態(tài)性遠遠超過RFLP 和RAPD 等技術, 因而被認為是指紋圖譜技術中多態(tài)性最豐富的一項技術。但該技術已申請專利, 在生產(chǎn)及商業(yè)上的應用受到一定的限制。</p><p><b>　

10、　1.4 SSR</b></p><p>　　SSR 是簡單序列重復, 稱為微衛(wèi)星DNA(microsatallite DNA) , 是近幾年在PCR 基礎上發(fā)展起來的第二代分子標記。SSR 是一種真核生物基因組中普遍存在的重復序列, 重復序列一般由1～6 個堿基組成, 重復次數(shù)在不同物種或同一物種不同基因型之間是高度可變的。這些重復序列兩端大多是保守的單拷貝序列, 因此可以根據(jù)保守序列設計特異引物,

11、 通過PCR 技術將中間的核心重復序列擴增出來, 利用瓊脂糖電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳分析技術可獲得其長度多態(tài)性。SSR 具有RFLP 的所有遺傳學優(yōu)點, 且避免了RFLP 技術中的使用放射性同位素的缺點, 又比RAPD 的重復性和穩(wěn)定性高, 因而目前已成為遺傳標記中的研究熱點。然而由于SSR 技術必須針對每個染色體座位的微衛(wèi)星, 發(fā)現(xiàn)其兩端的單拷貝序列才能設計引物, 這給微衛(wèi)星標記的開發(fā)帶來一定的困難。</p><p

12、><b>　　1.5 ISSR</b></p><p>　　ISSR 是一種新型的分子標記, 是由Zietkiewecz 于1994 年創(chuàng)建的一種簡單序列重復間擴增多態(tài)性的分子標記。它的生物學基礎仍然是基因組中存在的SSR。ISSR 標記根據(jù)生物體中廣泛存在SSR 的特點, 利用生物體基因組中出現(xiàn)的SSR 本身設計引物, 無需預先克隆和測序。ISSR 通常為顯性標記, 呈Mendel

13、式遺傳, 且具有很好的穩(wěn)定性和多態(tài)性, 因而是非常理想的分子標記之一, 可用于構建PCR 為基礎的分子圖譜。但它與RAPD 相似, 不能鑒別檢測位點的純合與雜合狀態(tài)。</p><p><b>　　1.6 SNP</b></p><p>　　1994 年, SNP 這個術語第一次出現(xiàn)在人類分子遺傳雜志上, 隨后Lander[13]第一次正式提出SNPs 為新一代分子標記

14、。簡單地講, 它是指基因組DNA 序列中由于單個核苷酸(A, T, C, G) 的替換而引起的多態(tài)性。因此, 通常所說的SNPs 不包括堿基的插入、缺失以及重復序列拷貝數(shù)的變化。</p><p>　　SNP 是繼RFLP 和SSR 之后發(fā)展起來的第三代分子標記技術。與前兩代分子標記技術相比, 它具有以下優(yōu)點: ( 1) 數(shù)量多, 分布廣泛。它是目前為止分布最為廣泛、存在數(shù)量最多且標記密度最高的一種遺傳多態(tài)性標記;

15、 ( 2) 遺傳穩(wěn)定性高, 遺傳分析重現(xiàn)性好且準確性高; ( 3) 易于快速且高通量地進行基因型分型。由于SNP 的二態(tài)性, 非此即彼, 在基因組中往往只需＋ /－的分析, 而無須象檢測SSR 標記那樣分析片段的長度, 這就有利于自動化的篩選或檢測技術的開發(fā)。</p><p>　　2、水產(chǎn)動物的表型性狀遺傳特點</p><p>　　2．1與鯉魚抗寒性狀相關的RAPD 分子標記在利用RAPD

16、2PCR 技術研究鯉魚抗寒性狀的過程中,最希望得到的是抗寒的父本和越冬存活的F2代混合樣具有的分子標記,而不抗寒的母本和越冬死亡的F2代混合樣都不具有的分子標記。但在本研究中發(fā)現(xiàn),所篩選到的幾個標記都是抗寒親本具有、不抗寒親本不具有,而兩個F2代混合樣都具有,但在PCR 擴增量上抗寒與不抗寒F2代存在差異,即產(chǎn)生了一個拷貝數(shù)差異的圖譜。分析認為,魚類在越冬過程中引起死亡的原因有很多,遺傳因素決定其不抗寒是引起越冬死亡的主要因素,由于操作

17、不當對魚體產(chǎn)生損傷引發(fā)疾病也是產(chǎn)生死亡的一個因素。因此在越冬過程中很可能造成的極少數(shù)具有抗寒能力的子代混入到死亡群體中,從而產(chǎn)生上述的結果。另外,作者認為魚類在某些與抗寒相關基因的表達量上存在一定的差異,而表達量達不到一定水平很可能是引起越冬死亡的另一個因素。在以往利用分子標記進行抗寒分析過程中,筆者獲得了許多與抗寒性狀相關的分子標記,據(jù)此確定魚類的抗寒性狀是受多基因控制的是一個數(shù)量性狀,一個基因拷貝數(shù)的不同對抗寒魚群體之間的遺傳不同有

18、很大的影響。而在提高鯉魚抗寒能力的育種研究過程中,親本將抗寒性</p><p>　　由于RAPD 技術具有的操作簡單、快捷、無需知道目標序列的有關信息、無種屬特異性等優(yōu)點,這對研究背景相對貧乏的魚類抗寒研究進入基因組水平是非常有意義的。但由于RAPD 技術存在的重復性差、實驗結果不具有可比性等缺陷使其在數(shù)量性狀基因的定位等研究上難以進行。Weeden 等的研究也表明,RAPD 技術本身存在5 %～10 %的檢測誤

19、差。因此目前采用的RAPD 技術并不是進行魚類抗寒研究的最好方法。在今后的研究中,應該更多的采用共顯性分子標記。同時,在實驗過程中,雖然通過嚴格的控制實驗條件,比如,獲得高質量的模板、穩(wěn)定高效的Tag 酶、優(yōu)化的反應條件、專一的實驗器材,利用RAPD 技術依然能夠得到重復性好,且比較穩(wěn)定的實驗結果。但是其信息量少,進行常規(guī)PCR 困難等缺點,需要將其轉化為共顯性分子標記才得以解決。SCAR 標記作為一種共顯性的分子標記具有的重復性好、信

20、息量大等一些優(yōu)點,已經(jīng)被越來越多的國內外學者應用。比較RAPD 分子標記而言,這種共顯性的SCAR 標記更加適合魚類抗寒性狀方面的研究,在魚類耐寒育種研究問題上具有更加廣闊的應用前景。</p><p>　　2.2對蝦抗病性狀遺傳標記</p><p>　　抗病性狀一般有多個基因控制。分子標記輔助育種主要用于單基因或少數(shù)基因的遺傳轉移和抗病性狀多個基因的聚合。在抗病性育種實踐中，單個基因控制的

21、抗性品種容易被病原體克服而造成大面積流行。因此，利用分子標記技術對抗病基因進行標記和定位，然后將不同的抗性基因聚合到一個優(yōu)良品種中，可能會產(chǎn)生新的抗性或使抗性得到提高，從而有利于培育具有持久抗性的品系或品種 (周錦霞等2005)。Huang等(1997)用分子標記在雜交F4代將4個抗白葉枯基因(Xa一44，Xa一5，Xa一13和Xa一21)聚于IRBB60品系中。王心宇等(2001)采用在早代進行抗性鑒定，較晚世代(F4代)進行抗性鑒定

22、結合分子標記輔助選擇的策略，利用了與3個小麥白粉病抗性基因緊密連鎖或共分離的RFLP標記和PCR標記 (SCAR標記)，對含有這些基因的優(yōu)良品系間配制的雜交組合的F4代進行了分子標記輔助育種選擇，并結合抗性鑒定，篩選到共36株結合其中兩個抗性基因的植株。</p><p>　　本研究利用RAPD技術對在攻毒過程中分離出的兩個群體進行分析，得到7個在兩個群體中表型頻率差異顯著的位點，其中5個位點在SLT群體中的表型頻

23、率顯著高于SST群體，說明這5個位點可能與抗病性狀相關。另外，兩個位點S1020—4和S1176—4在SST群體中的表型頻率顯著高于在SLT群體，說明這兩個位點可能是與抗病負相關的特異性遺傳標記。其中引物SLO2O產(chǎn)生兩個特異性位點，一個與抗病正相關位點SLO2O一1，一個負相關位點S1020—4。利用這些與抗病相關的遺傳標記進行輔助育種，可以大大加快育種進程。</p><p>　　3、分子標記技術的在水產(chǎn)動物表

24、型性狀遺傳研究中的應用</p><p>　　3.1　RAPD技術在魚類、蝦蟹類研究中的應用</p><p>　　3.1.1在遺傳資源研究中的應用</p><p>　　目前，海產(chǎn)蝦、蟹類遺傳變異的檢測大多通過檢測同工酶的變異來進行，所揭示的同工酶的多態(tài)性相對較低。RAPD分析中所需的樣品量極少，其操作程序簡單易行，實驗周期短，因而可以對數(shù)量較多的樣品進行分析。利用一套

25、引物可得到不同種屬、品系、群體甚至是個體的大量的RAPD分子標記，并可借助于計算機進行系統(tǒng)分析，RAPD技術的這些特點使得它可以在蝦、蟹類群體遺傳學、遺傳多樣性分析中發(fā)揮重要作用。</p><p>　　RAPD標記可以用來進行蝦、蟹類群體遺傳學研究，檢測種群內、種群間的遺傳多樣性水平，并為種群識別提供可靠的遺傳標記。Garcia等嘗試在斑節(jié)對蝦中利用RAPD分析不同地理群體間的遺傳多樣性，并就其在蝦類選育中的應用

26、作了初步探討。Garcia以及A1civar—Warren等在高健康(High Health Shrimp)和無特異病原(Specific—Pathogen—Free,SPF)的南美白對蝦培育中，用RAPD技術對野生種群以及不同的家系進行監(jiān)測和分析，發(fā)現(xiàn)其多態(tài)位點的比例為50%左右，其中一個家系的多態(tài)位點比例高達77%。劉萍等用RAPD技術對中國對蝦黃渤海沿岸種群親本及子一代的基因組DNA多態(tài)性進行了研究，結果證實子代之間的遺傳距離比其

27、父母與子代之間更小，遺傳變異程度更低。邱高峰等用RAPD技術分析了我國近海煙臺、長島等4個地方的20只中國對蝦的種群內和種群間遺傳差異，結果表明不同地理種群之間存在一定程度的遺傳差異。石拓等,劉萍等、劉振輝等對中國對蝦不同地理種群的遺傳多樣性進行了RAPD分析，結果表明，中國對蝦的遺傳多樣性水平較低。高志干等對中華絨螯蟹的遼河和長江種群進行RA</p><p>　　一個較為詳細的遺傳連鎖圖譜不僅對該物種的遺傳學基

28、礎研究有重要意義，同時對該物種的育種研究也很有幫助。Potlethwait和Stephen等用RAPD技術進行斑馬魚遺傳連鎖圖譜的制作。Liu把RAPD技術應用到鯰魚基因圖譜研究中。孫效文等建立了鯉魚的遺傳連鎖圖譜。圖譜有RAPD分子標記56個，鯉魚的SSLP標記26個，鯽魚的SSLP標記有19個，斑馬魚的SSLP標記有70個，鯉魚基因標記91個，圖譜有50個連鎖組，連鎖圖給出鯉魚的基因組大小在5789cm左右。</p>

29、<p>　　3.1.2確定種、品種間的親緣關系種群親緣關系的傳統(tǒng)研究方法是從形態(tài)學、細胞學、生化指標等方面進行，但受個體和環(huán)境的影響較大，有時不能反映物種本身所固有的特征。物種基因組的組成在RAPD圖譜上得到體現(xiàn)，親緣關系越近，基因組中的同緣序列越多，則以相同引物擴增出的共有標記也就越多。因此，RAPD技術與傳統(tǒng)方法結合是研究物種親緣關系的有效手段。對不同種、同種不同群體的DNA進行RAPD分析，篩選出特征性條帶，計算相似系

30、數(shù)和遺傳距離，從而可確定它們的親緣關系。李思發(fā)等用RAPD技術研究中國沿海六水系絨螯蟹(中華絨螯蟹和日本絨螯蟹)群體的親緣關系，從48個引物中篩選出2個具有群體特異性的引物，其中Z2擴增的880bp片段為珠江蟹和南流江蟹兩群體所共有，擴增的700bP片段為長江蟹、黃河蟹、遼河蟹、甌江蟹四群體所特有。這可作為區(qū)別中華絨螯蟹(長江蟹、黃河蟹、遼河蟹、甌江蟹)和日本絨螯蟹(珠江蟹、南流江蟹)的分子遺傳標記。用RAPD技術對中國沿海六水系絨螯蟹

31、進行兩大類型劃分與生化遺傳差異分析、形態(tài)特征多元分析的結果一致。宋林生等用RAPD方法研究對蝦屬六個種間的親緣關系，用20個隨機引物擴增，共得</p><p>　　Borrwsky等用隨機引物擴增產(chǎn)物重新構建了脊椎動物DNA指紋圖。Sultman等用DNA標記對麗魚科魚類的系統(tǒng)發(fā)育進行了研究。何舜平等運用RAPD的方法對五種鯉科魚類進行了分析，并論述了鮈鯽的系統(tǒng)位置。何舜平等通過對鯉科魚類的隨機擴增，獲得了大量有

32、系統(tǒng)發(fā)育信息的DNA多態(tài)片段，并繪制了低等鯉科魚類代表屬種的分支系統(tǒng)圖。夏德全等用RAPD方法分析太湖大銀魚、太湖新銀魚和寡齒新銀魚的親緣關系，同時發(fā)現(xiàn)有個別樣品的核基因組與太湖中已有的幾種銀魚有顯著差異。鄒曙明等用RAPD方法研究草魚、柏氏鯉和3個地理種群鯉的親緣關系，研究結果支持中國東部魚類具有雙重來源性的觀點。</p><p>　　3.1.3特定基因的標記</p><p>　　利用D

33、NA分子水平上的變異作為遺傳標記進行基因標記已成為可能。周開亞等用RAPD方法研究鑒別中華絨螯蟹種群，用200個隨機引物對中華絨螯蟹遼河種群、長江種群和甌江種群進行RAPD分析，其中引物HX01和HX02檢測到甌江種群和遼河種群所有樣品共有HX01—0.4和HX02—0.7擴增片段；而長江種群樣品的PCR反應中無這兩個擴增片段出現(xiàn)，因而可作為長江種群的鑒別標記。未發(fā)現(xiàn)可區(qū)分甌江種群和遼河種群的標記。謝浩等用RAPD方法研究三種絨螯蟹的親

34、緣關系，用引物OPO—05對25個中華絨螯蟹個體、27個日本絨螯蟹個體及12個日本絨螯蟹合浦亞種個體擴增，發(fā)現(xiàn)中華絨螯蟹所有個體都能擴增出一條大小約為1kb的區(qū)帶，且相當明顯和穩(wěn)定，而其它兩種在相同條件下僅有個別個體能擴增出相當微弱的區(qū)帶。因此，可將這一區(qū)帶作為一個遺傳標記，用于鑒別中華絨螯蟹與日本絨螯蟹及其合浦亞種。</p><p>　　目前RAPD已廣泛應用于鑒別、鑒定不同的生物種類。Johnson用RAPD

35、技術鑒定了不同實驗室品系的斑馬魚。薛國雄對長江、珠江、黑龍江三大水系的草魚產(chǎn)卵場及太湖中捕撈的草魚進行覆蓋性的RAPD分析，結果表明每一水系的草魚種群均有其特征性基因圖譜，可作為種群鑒定的依據(jù)。夏德全等應用該技術檢測了一個奧利亞羅非魚養(yǎng)殖群體和湘湖，美國和沙市三個尼羅羅非魚養(yǎng)殖群體，獲得了鑒別尼羅羅非魚和奧利亞羅非魚的分子遺傳標記。姚紀花等利用20個隨機引物對產(chǎn)于方正、彭澤和淇河地區(qū)的三個銀鯽種群進行了RAPD檢測，也獲得了銀鯽種群鑒定

36、的分子標記。鄧懷等對青魚、草魚、鰱魚、鳙魚、鯽魚、鯉魚、團頭魴、胭脂魚、土鯰和黃顙魚進行了RAPD—PCR擴增。結果顯示RAPD是一種非常靈敏的種間鑒定技術，特別是對魚卵和魚苗的鑒定有重要意義。鄭光明等以池養(yǎng)的鯪、麥鯪為材料，提取血液基因組DNA，利用隨機引物進行PCR擴增，通過縮短擴增時間和電泳時間，快速鑒定了三種不同的鯪魚，并建立了一套DNA分子水平上的快速鑒定魚種的方法。</p><p>　　3.1.4識別

37、同一物種的性別差異</p><p>　　蝦、蟹的性染色體沒有統(tǒng)一的模式，用常規(guī)核型分析方法不能鑒別性染色體。通過RAPD技術可找出同一物種不同性別的基因組DNA特征性條帶，從而有助于研究性別控制機制，也可為性別確定提供分子依據(jù)。邱濤用RAPD技術識別中華絨螯蟹的性別，200個引物中有17個引物擴增出群體水平的差異，其中一個引物(OPM14)擴增出個體水平的差異：雄性有一個800bP的特異帶，而雌性沒有。這可作為有

38、價值的性別鑒別標記。</p><p>　　3.1.5監(jiān)測遺傳滲入，維持物種遺傳多樣性</p><p>　　目前，人為的養(yǎng)殖活動、人工放流等使得蝦、蟹類種內不同種群間非自然的遺傳滲入已相當普遍，應引起重視，需加以監(jiān)測并收集數(shù)據(jù)，為保護種質資源、維持物種遺傳多樣性提供依據(jù)。李思發(fā)等用RAPD指紋標記研究中國大陸六水系絨整蟹的親緣關系，引物OPP17擴增的947bP片段的出現(xiàn)頻率，在長江、黃河、

39、遼河三群體中顯著地從南到北遞減，長江蟹87.5%、黃河蟹41.66%、遼河蟹10.83%。這一遺傳滲入的度量可作為區(qū)別三水系中華絨螯蟹的判據(jù)。邱濤等用RAPD方法研究中華絨螯蟹長江、遼河、甌江水系三群體的遺傳多樣性，并未發(fā)現(xiàn)三群體間存在特征性條帶，但群體間差異大于群體內差異。未發(fā)現(xiàn)群體間的分子遺傳標記，但三群體間確實存在差異，表明近來種質資源混雜，遺傳滲入是其中原因之一。 RAPD標記可用于群體遺傳學研究，檢測種群內、種群間的遺

40、傳多樣性水平，并為種群識別提供可靠的遺傳標記。Bardakci等用RAPD技術評估了羅非魚的種群內、種群間的遺傳變異度。Bielawski等進行了太平洋海岸條斑鱸的RAPD分析。Caccone等對歐洲尖吻鱸的DNA多態(tài)性進行RAPD—PCR分析。Garcia等嘗試在斑節(jié)對蝦</p><p>　　RAPD技術程序簡單快捷，且無需事先確定目的基因的序列，無種屬特異性，有無數(shù)的引物可供利用，能產(chǎn)生足夠的多態(tài)性，無需同位

41、索，可以鑒別物種之間和種群之間的基因組的差異，也可區(qū)分個體之間的差異。為此，許多從事水產(chǎn)育種工作的科研人員已把RAPD技術應用到水產(chǎn)遺傳育種上，并已取得—定的成果。在海水魚類(如大黃魚等)、海水蝦類的種質資源研究中，由于同工酶所揭示的種內水平上的遺傳差異水平非常低，而RAPD比同工酶更能指示DNA多態(tài)性，因此RAPD分子標記在魚類、蝦類、蟹類種質資源遺傳學研究中有著廣泛的應用前景。目前RAPD分析主要應用于標記鑒定、遺傳作圖、系統(tǒng)發(fā)育和

42、進化及親緣關系的研究、種群的劃分、群體遺傳多樣性研究等。但在實際應用中，RAPD也表現(xiàn)出不足，如顯陽性位點，在后代中不能區(qū)別是純合體還是雜合體；穩(wěn)定性較差；高度的變異性等缺點。當然有些是可以避免的，解決的方法是對單鏈引物進行篩選，優(yōu)化反應條件，但第一個缺點是無法避免的。如能把RAPD與其它分子標記如RFLP、AFLP和微衛(wèi)星等結合使用，RAPD仍將會發(fā)揮更好的用途?？傊?，隨著生物技術的不斷發(fā)展和更多應用，RAPD技術也將更加完善，應用更

43、</p><p>　　3.2吉富羅非魚雌雄群體遺傳差異的SSR分析</p><p>　　運用SSR技術對吉富羅非魚的雌、雄群體間的分子遺傳結構及其變異進行了分析，結果顯示，雌雄吉富羅非魚群體的多態(tài)性位點比例、PIC、基因多樣性指數(shù)和Shan。non氏指數(shù)的值基本一致，表明國家級廣西南寧羅非魚良種場的P8代吉富羅非魚經(jīng)過多代選育后雌、雄性群體的遺傳差異已經(jīng)很小。董在杰等(2007)利用RAP

44、D技術對奧利亞羅非魚和尼羅羅非魚的雌、雄群體間的分子遺傳結構及其變異進行了分析，結果顯示，雌雄奧利亞羅非魚群體的多態(tài)性位點比例、基因多樣性指數(shù)和Shan．non氏指數(shù)的值基本一致，與本研究中的結論相似。</p><p>　　4、研究進展和研究展望</p><p>　　4.1.1種群遺傳多樣性分析和種質資源的評估　在海水魚類資源的開發(fā)與保護中,對魚類種群的種質資源進行科學地評估十分重要。利用

45、DNA分子標記技術分析自然種群與人工養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性和不同種屬間或地理群體間的遺傳差異,了解魚類種群關系、進化地位,監(jiān)測魚群遺傳漸滲和評估人工增殖放流效果等,這些都有利于魚類資源的保護、開發(fā)和利用。</p><p>　　孟憲紅采用RAPD技術對真鯛野生群體及人工繁殖群體進行了DNA多態(tài)性檢測,認為真鯛野生群體及人工繁殖群體的遺傳多樣性較為豐富,但人工繁殖群體的遺傳多樣性低于野生群體。王志勇等利用AFLP技術研

46、究了我國沿海真鯛群體的遺傳變異,結果顯示:北部灣群體的變異量最低,它與威海群體的遺傳差異顯著,兩者明顯屬于相互獨立的不同亞種群。 申雪艷等利用RAPD和微衛(wèi)星2種分子標記技術分析了從法國、英國、西班牙引進我國的3個大菱鲆群體的遺傳結構。 McConnel S利用微衛(wèi)星技術研究了加拿大東海5個大西洋鮭群體的遺傳多樣性和群體結構. Nakabo等利用微衛(wèi)星技術對東南亞海區(qū)鱸魚進行分析,推翻了東亞地區(qū)只有1種鱸魚的說法。 蒙子寧等運用RAPD

47、 分析了采自黃海和東海5個海區(qū)的小黃魚的遺傳多樣性,從分子水平上支持了過去有關學者把黃海和東海的小黃魚劃分為北、中、南3 個地理群系的觀點. Perez2Enriquez等利用微衛(wèi)星3 個DNA 位點分析了包括中國、日本和太平洋西南部8個地點的真鯛( Pag rus m a jor ) 的遺傳差異,證明太平洋北部與西南部的群體遺傳差異明顯。Roques等應用微衛(wèi)星D</p><p>　　4.1.2分子系統(tǒng)發(fā)育和親

48、緣關系的分析　分子系統(tǒng)發(fā)育(Molecular phylogenetics)是指基于分子數(shù)據(jù)尤其是DNA序列來研究有機體間的進化和親緣關系。物種間親緣關系的研究為確定育種方案、預測雜交優(yōu)勢提供了重要的理論依據(jù),近年來,魚類分子系統(tǒng)發(fā)育的研究取得了很大的進展。Garrido2Ramos等用具有EcoRⅠ酶切位點的中著絲粒微衛(wèi)星DNA家族序列對鯛科( Sparidae)各屬間的系統(tǒng)發(fā)育關系進行了分析。 Oakiley等根據(jù)GHC (生長激素

49、內含子C)序列分析,認為大麻哈魚屬 (O ncorhynchus) 為單系,這與形態(tài)學和其他分子數(shù)據(jù)(包括核基因和線粒體基因)一致,但不支持被廣泛接受的大麻哈魚屬和大西洋鮭屬(S a lm o) 為姊妹屬的看法,不過,他們認為這仍需進一步的研究來證實;同時,他們還認為基于GHC序列的鮭科魚類的分子系統(tǒng)發(fā)育關系是目前所有分子數(shù)據(jù)中最好的。 高天翔等對養(yǎng)殖褐牙鲆( Pa ra lich thys olivaceus) 的線粒體DNACytb

50、基因的部分序列進行了測定,認為由于褐牙鲆Cytb基因具有高度同源性,因此研究其白化、黑化和正常</p><p>　　4.1.3種類(品種)的鑒定　在魚類育種過程中,準確地鑒定和篩選具有優(yōu)良遺傳變異的個體是育種工作的前提,但魚類個體標志、家系標志甚至群體和種類標志一直是難以解決的問題,而且有些遺傳變異性是早期無法鑒定和篩選的(如產(chǎn)卵量、品質、成熟期等) ,有些變異性狀則需要創(chuàng)造逆境才能知曉,如抗病力、抗逆性等,這些

51、都給魚類遺傳育種帶來了困難。DNA分子標記技術的發(fā)展無疑為解決這一難題提供了有力的工具,如果利用這些性狀跟DNA分子標記緊密連鎖,不但能夠早期選擇這些性狀,而且還不需創(chuàng)造逆境條件,這不僅可以節(jié)省大量的人力、物力和時間,而且能提高育種的效率。</p><p>　　4.1.4分子標記輔助選擇(Ma rke r a s s is ted se le c tio n,簡稱MAS ) 　所謂分子輔助選擇育種技術就是利用分子

52、標記的手段,結合其他育種手段和方法,選育和培育新品種的育種技術。 自20世紀80年代以來, DNA分子標記等遺傳標記被廣泛應用于遺傳育種領域,形成了多種遺傳方法有機結合的有效育種途徑。應用分子標記輔助選擇育種,可以提前預知選育的結果,大大提高了選育的效率。一般認為,應用傳統(tǒng)的選育技術,每代的遺傳獲得量(Genetic gain)通常僅在10% ～15%;而應用分子標記輔助選擇育種技術后可明顯提高選育進度,特別是對那些傳統(tǒng)表型工具難以度量

53、的性狀的選育,如抗病力、肉質、餌料系數(shù)、對溫度和鹽度的耐受能力等,因此,這一育種技術必將成為21世紀水產(chǎn)養(yǎng)殖生物育種的新熱點和新趨勢。</p><p><b>　　5、小結</b></p><p>　　我國海域廣闊,魚類資源豐富,因此應充分利用分子遺傳標記的優(yōu)勢,加強對我國主要海水魚類資源的監(jiān)測,主要是跟蹤調查各種經(jīng)濟魚類的遺傳多樣性水平、群體遺傳結構、不同種間的親緣

54、與進化關系、不同地理群體的遺傳變異和種源區(qū)的劃分等,同時開展人工繁殖與養(yǎng)殖、人工放流等行為對自然群體遺傳的影響等方面的研究,在分子水平上為海水魚類養(yǎng)殖、資源保護和遺傳育種等提供依據(jù)。</p><p>　　大多數(shù)魚類的重要經(jīng)濟性狀,如抗病力、生長速度、肉質等都表現(xiàn)為數(shù)量性狀遺傳,應用傳統(tǒng)的遺傳育種標記方法無法確定這些重要性狀是由哪些具體的基因控制的,因此DNA分子標記技術無疑是魚類遺傳育種的有力工具。應用DNA分子

55、標記技術進行魚類種質資源研究、遺傳結構特征分析、品種鑒定、資源狀況的調查和評估,將有利于海水魚類資源的保護、管理和開發(fā);應用DNA分子標記分析魚類親緣關系、預測雜交優(yōu)勢、檢測和評估育種效果、篩選優(yōu)良品種,將有利于海水魚類優(yōu)良品種的選育、培育研究;應用DNA分子標記分析與重要經(jīng)濟性狀有關的連鎖基因,有利于重要經(jīng)濟性狀基因的篩選、分離與克隆,從而有利于促進海水魚類的品系改良和轉基因魚的研究。由此可見,應用DNA分子標記技術來開展海水魚類遺傳

56、育種是突破傳統(tǒng)育種、有效開發(fā)和保護海水魚類資源的重要途徑,它將成為海水魚類遺傳學家和育種學家討論的熱點問題和研究主流。</p><p><b>　　參考文獻：</b></p><p>　　［1］賈繼光。分子標記種質資源鑒定和分子標記育種［J］。中國農(nóng)業(yè)科學，1996，29（4）：1-10。</p><p>　　［2］梁明山，曾宇，等。遺傳標記及

57、其在作物品種鑒定中的應用［J］。植物學通報，2001，18（3）：257-265。</p><p>　?。?］葛頌，洪德元。遺傳多樣性及檢測方法［A］，見錢迎倩，馬克平。 生物多樣性研究的原理和方法［M］。 北京：中國科學技術出版社，1994。</p><p>　　［4］張德強，張志毅。分子標記技術在楊樹遺傳變異及系統(tǒng)分類中的應用［J］。北京林業(yè)大學學報，2001，23（1）：76-80。

58、</p><p>　?。?］李斌，顧萬春，陳曉陽。AFLP標記在生物種質資源研究中的應用［J］。 世界林業(yè)研究，2001，14（4）：15。</p><p>　　［6］Agresti ,J . J . , Seki S , Cnaani ,A. , Poompuang S. , Hallerman , E. M. , Umiel , N. , Hulata , G. , Gall , G.

59、 A. E. ,and May , B. 2000. Breeding new strains of tilapia : Development of an artificial center of origin and linkage map based on AFL P and microsatellite loci. Aquaculture , 185 : 43～56.</p><p>　　[7] 楊萍，鄭

60、前劍,，趙明水，等。 柳杉CAPS 遺傳標記反應體系的優(yōu)化[J]。 浙江林學院學報，2006， 23(1):52-55。</p><p>　　[8]陸忠康. 簡明中國水產(chǎn)養(yǎng)殖百科全書[M ]. 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2001: 574 - 580.</p><p>　　[9]邱芳, 伏健民, 金德敏,等. 遺傳多樣性的分子檢測[ J ]. 生物多樣性, 1998, 6 (2) : 143 -

61、150.</p><p>　　[10] NAKABO T. The third international symposium on the marine sciences of the yellow sea ( abstracts) ,Qingdao: Ocean Press, 1994: 81.</p><p>　　[11]杜長斌,樓允東,沈俊寶,等. 微衛(wèi)星分子標記技術在魚類遺傳連鎖

62、圖譜構建中的應用[ J ]. 上海水產(chǎn)大學學報, 2000, 9 (3) : 254 - 258.</p><p>　　[12] CO IMBRA M R M, KOBAYASH I K, KORETSUGU S, et al. A genetic linkage map of the Japanese flounder Pa ra lich thysolivaceus [ J ]. Aquaculture, 2