1、柞蠶是一種具有重要經(jīng)濟價值的野生絹絲昆蟲，屬于鱗翅目、大蠶蛾科、柞蠶屬。柞蠶繭可作為紡織工業(yè)原料使用，其幼蟲和蛹還具有重要的藥用和食用價值。盡管昆蟲在高溫和低溫等不利環(huán)境下的生活史對策已有較多研究報道，但柞蠶對于高溫耐受性的生化與分子機制仍未被解析。熱激蛋白(heatshockproteinHsp)是一種抗逆蛋白，在細胞受到脅迫時表達量會增加，對細胞起到一種保護作用，幫助生物機體度過不利環(huán)境條件。近期的研究還表明，HSPs還與生物的生長

2、、發(fā)育與分化、細胞內(nèi)信號傳導和育性轉(zhuǎn)化有關(guān)。本論文在克隆獲得柞蠶熱激蛋白90(Hsp90)基因序列的基礎(chǔ)上，進一步對蛹在不同溫度脅迫下的相對表達量進行了測定，并且大腸桿菌內(nèi)進行了成功的表達，從而為闡明柞蠶耐高溫的分子機制提供參考。主要結(jié)果如下：
　　 1.柞蠶Hsp90克隆及序列分析：
　　 根據(jù)GenBank中昆蟲熱激蛋白基因序列同源性設(shè)計簡并引物，利用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)結(jié)合cDNA末端快速擴增(RA

3、CE)技術(shù)成功克隆了柞蠶Hsp90基因cDNA全長序列。柞蠶Hsp90基因cDNA全長序列序列全長2482bp，開放閱讀框長2154bp，編碼717個氨基酸。預測的該蛋白的相對分子量和等電點分別為82.6kDa和5.0。該序列具有Hsp90家族的典型特征和特殊的功能結(jié)構(gòu)域，并且與多種生物的Hsp90核苷酸序列以及推導的氨基酸序列都具有較高的同源性。系統(tǒng)進化分析表明，柞蠶Hsp90和天蠶的Hsp90氨基酸同源性最高，為94.5％。

4、　　 2.高溫脅迫下柞蠶體內(nèi)Hsp90基因表達量的變化
　　 提取柞蠶幼蟲及蛹期的不同組織的RNA，反轉(zhuǎn)錄為第一鏈cDNA進行半定量RT-PCR。實驗結(jié)果表明，Hsp90在精巢中的表達量較高，而其他被檢組織中的表達量無明顯差異。
　　 利用18SrRNA作為內(nèi)參基因，以柞蠶不同組織的RNA為模板，結(jié)合實時熒光定量PCR(SBGYReal-timePCR)技術(shù)分別檢測了25℃和42℃脅迫處理30min后柞蠶蛹期體內(nèi)Hsp

5、90基因相對表達量。結(jié)果表明，Hsp90基因表達量隨著溫度升高呈增加的趨勢。42℃脅迫下，不同組織內(nèi)的Hsp90基因表達量均高于對照的(P<0.05)。Hsp90基因較高的表達水平說明這種蛋白在柞蠶抗高溫中起到一定的保護作用。
　　 3.Hsp90基因的原核表達
　　 PCR法擴增了柞蠶熱激蛋白90的ORF，并連接至pET-28a(+)表達載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)菌株中，用不同濃度的IPTG進行了誘導表達，經(jīng)