1、<p>　　壓力超負(fù)荷大鼠心室肌細(xì)胞Bax、Bcl</p><p>　　作者：羅承鋒，黃衍壽，劉月嬋，冼紹祥，洪永敦，劉煜德 </p><p>　　【關(guān)鍵詞】 心室肌細(xì)胞 </p><p>　　摘要：【目的】觀察腹主動(dòng)脈縮窄造成的壓力超負(fù)荷大鼠模型左心室肌細(xì)胞B細(xì)胞淋巴瘤/白血病基因蛋白(Bcl2蛋白)及其家族成員Bax蛋白表達(dá)的序列變化?！痉椒ā繅毫?/p>

2、超負(fù)荷大鼠各時(shí)間點(diǎn)(造模后1、4、7、10、21、30、40d)Bax、Bcl2蛋白的表達(dá)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行胞內(nèi)抗原定量檢測(cè)?！窘Y(jié)果】在腹主動(dòng)脈縮窄之后第1天，大鼠左心室肌細(xì)胞Bax蛋白的表達(dá)率較高(6375%)，Bcl2蛋白的表達(dá)率則較低(3145%)，Bax/Bcl２較高(202)；在以后的觀察點(diǎn)中，Bax蛋白的表達(dá)率變化不大，波動(dòng)于50%～60%之間，而Bcl2蛋白的表達(dá)則于第7天升至最高值(7175%)，爾后開始下降，第30天時(shí)其

3、表達(dá)率最低(228%)；Bax/Bcl2于第4天時(shí)下降，第7天時(shí)降至最低，隨后開始逐漸上升，第30天達(dá)到峰值(24)，到第40天時(shí)又下降?！窘Y(jié)論】腹主動(dòng)脈縮窄造成的壓力超負(fù)荷大鼠模型左心室肌細(xì)胞凋亡發(fā)生的高峰可能在造模后的第30天。 </p><p>　　關(guān)鍵詞：細(xì)胞凋亡；心力衰竭，充血性/病因?qū)W；疾病模型，動(dòng)物；大鼠 </p><p>　　Bing在1994年就提出細(xì)胞凋亡是慢性壓力超負(fù)

4、荷導(dǎo)致心力衰竭的機(jī)制的假說［１］。越來越多的證據(jù)表明，壓力超負(fù)荷時(shí)存在著心肌細(xì)胞凋亡。B細(xì)胞淋巴瘤/白血病基因蛋白(Bcl2蛋白)及其家族成員Bax蛋白在細(xì)胞凋亡的調(diào)控過程中起著重要的作用。筆者對(duì)壓力超負(fù)荷大鼠心室肌細(xì)胞Bax、Bcl2蛋白的表達(dá)規(guī)律進(jìn)行了研究。 </p><p><b>　　1 材料與方法 </b></p><p><b>　　11 動(dòng)物及

5、分組 </b></p><p>　　普通級(jí)SD大鼠24只，雌性，體重180～220g，購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，隨機(jī)分為8組，即大鼠造模后第1、4、7、10、14、21、30、40d 8個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每組各3只。 </p><p>　　12 主要器材與試劑 </p><p>　　牙用不銹鋼絲(上海牙科醫(yī)械廠，批號(hào)：K41701)；分析天平(LIBROR

6、 AEU210，Shimadzu)；抽濾器(NALGENE,Nalge Company)；離心機(jī)(LD52A，北京醫(yī)用離心機(jī)廠)；光學(xué)顯微鏡(BH2，Olympus)；流式細(xì)胞儀(EPICS ALTRA，Beckman Coulter)。Ficoll(Sigma,華美生物工程公司分裝，批號(hào)：38H0588)；多聚甲醛(廣州化學(xué)試劑廠，批號(hào)：99010136)；小鼠抗大鼠Bax Ab4(6A7)(Neomarkers，批號(hào)：714P010

7、)；小鼠抗大鼠Bcl2α Ab4(10C4)(Neomarkers，批號(hào)：598P111)；藻紅蛋白(RPE)標(biāo)記的羊抗小鼠F(ab′)2IgG(Serotec，批號(hào)：280901)；封閉用羊血清(北京中山生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：ZLI9021)；RPE標(biāo)記的羊F(ab′)2IgG(Southern Biotechnology Associate Inc，批號(hào)：J366W490B)。 </p><p>　　13

8、心衰模型的復(fù)制 </p><p>　　以腹主動(dòng)脈縮窄法復(fù)制大鼠左心室壓力超負(fù)荷模型［２］。給大鼠腹腔注射100g&#12539;L－１水合氯醛，劑量35mL&#12539;kg－１，麻醉后，暴露腹主動(dòng)脈，并于雙側(cè)腎動(dòng)脈上方鈍性分離腹主動(dòng)脈，用4號(hào)縫合線將腹主動(dòng)脈和與腹主動(dòng)脈平行放置的外徑約06～09mm的牙用不銹鋼絲一并結(jié)扎，然后輕輕取出不銹鋼絲，使腹主動(dòng)脈截面積縮窄至原來的25%～30%左右，造

9、成腹主動(dòng)脈狹窄，關(guān)腹。假手術(shù)組，鈍性分離腹主動(dòng)脈后，縫合線僅繞于腹主動(dòng)脈上，并不縮窄，且在術(shù)后3d內(nèi)給予肌肉注射青霉素(18000U&#12539;kg－１），以預(yù)防感染。 </p><p><b>　　14 取材 </b></p><p>　　大鼠稱體重(mbody)后，麻醉，開胸，迅速取出心臟，分別稱取整個(gè)心臟質(zhì)量(mheart)及左心室的質(zhì)量(mLV)，

10、將左心室剪成兩塊，用針將心肌穿孔；置于含600mL&#12539;L－１甘油的DMEM(Dulbeccos Modified Eagle Medium)的凍存管中，程序冷凍，最后保存于液氮中備用。 </p><p>　　15 心肌細(xì)胞的分離與純化［３］ </p><p>　　從液氮中取出保存的心臟，迅速放入40℃水浴中解凍；用DMEM清洗心臟；將左心室剪碎成1mm３的小塊，于Kre

11、bsHenseleit液中吹打10min以分離心肌細(xì)胞，必要時(shí)可重復(fù)1次；將含心肌細(xì)胞的溶液用100目網(wǎng)篩過濾，800r/min離心5min，01mol&#12539;L－１磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗2次，800r/min離心5min；將沉淀輕輕加入40g&#12539;L－１的Ficoll上，400r/min離心4min，棄上清，沉淀即為高純度的桿狀的心肌細(xì)胞。 </p><p>　　16 Ba

12、x、Bcl2蛋白的檢測(cè)［４，５］ </p><p>　　將所分離出的心肌細(xì)胞計(jì)數(shù)，各取1×１０６個(gè)細(xì)胞，分別加入4支試管中；40g&#12539;L－１多聚甲醛固定60min，1500r/min離心，棄上清，PBS清洗2次；將細(xì)胞重懸于10mL&#12539;L－１ Tween80中30min,1500r/min離心，PBS清洗3次；每管加入封閉用羊血清100μL,20min，5mL&a

13、mp;#12539;L－１ Tween80清洗1次，PBS清洗2次；每試管中加入100μL 1∶100的小鼠抗大鼠Bax或Bcl2抗體，室溫下孵育30min，加入5mL&#12539;L－１ Tween80孵育5～10min，1500r/min離心，PBS清洗2次；每試管中加入5μL RPE標(biāo)記的羊抗小鼠抗體或10μL RPE標(biāo)記的羊抗小鼠的同型對(duì)照，室溫下孵育30min，加入5mL&#12539;L－１Tween80孵

14、育5～10min，1500r/min離心，PBS清洗2次；各試管中加入PBS 400μL，待上機(jī)檢測(cè)。 </p><p>　　使用ALTRA流式細(xì)胞儀進(jìn)行Bax和Bcl2蛋白的檢測(cè)，結(jié)果用Bax、Bcl2的表達(dá)率和平均熒光強(qiáng)度表示。 </p><p><b>　　2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 </b></p><p><b>　　21 造模結(jié)果 &

15、lt;/b></p><p>　　24只大鼠中死亡8只，死亡大鼠均于3d內(nèi)死于急性左心衰，解剖發(fā)現(xiàn)雙肺明顯瘀血，部分還伴有胸腔積液，其死亡與急性壓力超負(fù)荷有關(guān)。 </p><p>　　22 各時(shí)間點(diǎn)大鼠心臟質(zhì)量變化 </p><p>　　從圖1和圖2可以看出，大鼠在造模后心臟質(zhì)量(mheart)、左心室的質(zhì)量(mLV)逐漸增加，第30～40天之間，其增幅有所

16、減少；心臟、左心室質(zhì)量與體重之比，即心臟質(zhì)量指數(shù)(CMI，IＣＭ＝mheart/mbody)、左心室質(zhì)量指數(shù)(LVMI，IＬＶ＝mLV/mbody)，亦隨時(shí)間的延長而增加，約于第30天達(dá)到最高值，可能與后負(fù)荷增加引起的代償性肥厚有關(guān)，到第40天時(shí)，二者的比值已開始降低。 </p><p>　　23 各時(shí)間點(diǎn)心肌細(xì)胞中Bax、Bcl2的表達(dá)情況 </p><p>　　從圖3～5可以看出，在腹

17、主動(dòng)脈縮窄后第1天，大鼠左心室心肌細(xì)胞Bax蛋白的表達(dá)率較高(6375%)，第4天已下降，在以后的時(shí)間中，其表達(dá)率變化不大，波動(dòng)于50%～60%之間；Bcl2蛋白的表達(dá)率于第1天時(shí)較低(3145%)，隨后上升，第7天升至最高值(7175%)，爾后開始下降，第30天時(shí)其表達(dá)率最低(228%)；RBax/RBcl2于第1天時(shí)較高，第4天時(shí)已下降，第7天時(shí)降至最低，隨后開始逐漸上升，第30天達(dá)到峰值(24)，到第40天時(shí)又下降，兩者熒光強(qiáng)度比

18、值的序列變化基本與表達(dá)率之比相似，其第1天的變化可能與突然的壓力超負(fù)荷有關(guān)。 </p><p><b>　　3 討論 </b></p><p>　　心臟的壓力超負(fù)荷情況下，心臟首先代償性地向心性肥厚，隨后，心肌細(xì)胞增長，心室腔的擴(kuò)大，心室?guī)缀涡螒B(tài)的變化，心肌細(xì)胞外間質(zhì)發(fā)生膠原沉積和纖維化，即心室重塑，最終因失代償而發(fā)生心衰，在此過程中心功能的進(jìn)行性惡化可能與心肌細(xì)胞凋

19、亡有關(guān)［１，６］。細(xì)胞凋亡受到程序控制，Bcl2和Bax是Bcl2家族中的重要成員，Bcl2蛋白抑制細(xì)胞凋亡，而Bax蛋白則促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Bcl2、Bax蛋白可形成同源二聚體，也可相互間形成異源二聚體，Bcl2與Bax的比例(RBcl2/RBax)決定細(xì)胞是否發(fā)生凋亡，盡管細(xì)胞內(nèi)這一比例是固定的，但外界刺激可以改變抑制凋亡的Bcl2Bax與促進(jìn)凋亡的BaxBax的量發(fā)生改變。隨著Bcl2表達(dá)的增多，BaxBax分開，形成Bcl2Bax異

20、源二聚體，若細(xì)胞中50%的Bax與Bcl2形成異源二聚體，即凋亡受抑；若80%的Bax以同源二聚體的形式存在，則細(xì)胞容易發(fā)生凋亡［７］。研究顯示，當(dāng)RBax/RBcl2＞2時(shí)，細(xì)胞凋亡，反之則存活。也有研究表明，Bcl2和Bax可獨(dú)立地調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。本文對(duì)腹主動(dòng)脈縮窄引起的壓力超負(fù)荷大鼠心室肌細(xì)胞表達(dá)Bax和Bcl2蛋白的規(guī)律進(jìn)行了研究</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)： </b><

21、;/p><p>　?。郏保軧ing O H L.Hypothesis:Apoptosis may be a mechanism for the transition to heart failure with chronic pressure overload［Ｊ］．J Mol Cell Cardiol,1994,26:943. </p><p>　　［２］Chang K C,Shreur J

22、 N,Weiner M W,et al.Impaired Ca２＋ remodeling is an early manifestation of pressureoverload hypertrophy in rat hearts［Ｊ］．Am J Physiol,1996,271(1 pt 2):H228. </p><p>　?。郏常蔹S衍壽，洪永敦，羅承鋒，等．成年大鼠心室肌細(xì)胞的超低溫液氮保存分離法［Ｊ］．

23、廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，19(4)：289． </p><p>　?。郏矗軩ragowska W H,Menezes D E L,Sartor J,et al.Quantitative fluorescence cytometric analysis of Bcl2 levels in tumor cells exhibiting a wide range of inherent Bcl2 protein

24、expression:correlation with western blot analysis［Ｊ］．Cytometry,2000,10:346. </p><p>　?。郏担軸tewart C C.Flow cytometric analysis of oncogene expression in human neoplasis［Ｊ］．Arch Pathol Lab Med,1989,113:634. &l

25、t;/p><p>　?。郏叮軸abbah H N,Shsrov V G.Apoptosis in heart failure［Ｊ］．Prog Cardiovasc Dis,1998,40:549. </p><p>　?。郏罚軴ltvai Z N,Milliman C L,Korsmeyer S J.Bcl2 heterodimerizes in vivo with a conserved h