1、番茄黃化曲葉病毒(Tomatoyellowleafcurlvirus,TYLCV)隸屬雙生病毒科(Geminiviridae)中的菜豆金色花葉病毒屬(Begomovirus),由煙粉虱(Bemisiatabaci)傳播。該病毒引起的番茄黃化曲葉病(Tomatoyellowleafcurldisease,TYLCD)幾乎遍及所有熱帶和亞熱帶地區(qū),危害嚴重,已成為世界番茄產(chǎn)業(yè)的主要限制性因素之一。TYLCV于2006年在我國首次報道后急速蔓

2、延,隨后在多個省市大面積爆發(fā),2008年在山東聊城、壽光、臨淄等多個地市發(fā)現(xiàn)TYLCV的嚴重危害,受災面積達95%,減產(chǎn)55%左右。為了弄清侵染山東番茄的雙生病毒種類,為進一步開展該病毒病害的防控研究提供理論依據(jù),我們在山東棗莊、菏澤、臨沂、泰安、濟南、淄博、濰坊、德州和濱州等9個區(qū)市的番茄主產(chǎn)區(qū)采集了140個疑似TYLCV侵染的番茄樣本,對其進行了病原分子鑒定和變異分析。
　　 利用雙生病毒簡并引物PA/PB在107個樣品中P

3、CR擴增得到約500bp的特異片段,在棗莊、菏澤、臨沂、泰安、濟南、淄博、濰坊、德州和濱州等地區(qū)番茄上雙生病毒的檢出率分別為91.7%,54.5%,66.7%,62.5%,75.0%,71.4%,85.0%,100%和80.0%。隨機選取2個陽性樣品對該片段進行克隆測序,經(jīng)序列比較發(fā)現(xiàn)這2個片段之間的相似性為98.5%,與已報道的TYLCV各分離物相應片段的相似性都在94%以上。隨機選取其中4個不同區(qū)市分離物SD11、SD28、SD39

4、和SD65,對其DNA-A全基因組進行了克隆和序列分析,結(jié)果表明,4個DNA-A全長分子均為2781nts,具有典型的Begomovirus屬病毒的基因組結(jié)構(gòu)特征,且與我國上海、安徽等地報道的TYLCV分離物相似性均在98.5%以上,表明它們是TYLCV的分離物。設(shè)計TYLCV特異性引物TYT-F/TYT-R對140個樣品進行PCR擴增,從107個樣品中均擴增到430bp大小的目的條帶,檢出率及檢出的樣品編號與PA/PB檢測結(jié)果相吻合。

5、PCR檢測表明,所有樣品中均未擴增到DNA-B組份,且未伴隨衛(wèi)星DNA分子。
　　 序列比較發(fā)現(xiàn),盡管TYLCV在世界范圍內(nèi)廣泛發(fā)生,但大多數(shù)分離物核苷酸序列相似性在93%以上,相較Begomovirus屬病毒其變異程度小。為了弄清楚其核苷酸序列保守的原因,為分析TYLCV的遺傳進化軌跡及番茄抗TYLCV分子育種提供科學依據(jù),本研究以山東和陜西自然感染TYLCV的田間番茄為材料,從分子克隆出發(fā),對TYLCVDNA-A的種群結(jié)構(gòu)、

6、變異水平及堿基突變類型進行了研究和分析。
　　 對TYLCV種群結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果表明,TYLCV符合病毒準種結(jié)構(gòu)的特性,即是由主序列和一系列十分相近但不完全一致的序列變異體共同組成的病毒群體。其種群突變克隆百分率及突變頻率均較低,分別為21.0%和2.36×10-4,其中2008年11月獲得的山東壽光分離物SD1DNA-A種群的變異水平與2011年11月獲得的陜西涇陽分離物SX15相當,而2011年7月獲得的山東壽光分離物SD98

7、DNA-A種群的突變頻率則較低,為5.42×10-5,即同種地區(qū)不同時間及不同地區(qū)相同時間獲得TYLCV種群變異水平無明顯規(guī)律。
　　 對TYLCV種群內(nèi)堿基突變的分析表明,堿基突變在IR-AC1區(qū)內(nèi)均有分布,但主要集中在IR5'區(qū)及AC1非重疊區(qū)。種群內(nèi)堿基突變類型主要是堿基的替代突變,且C-T之間的堿基顛換為種群的主要堿基突變類型。陜西分離物SX15種群出現(xiàn)了突變積累的現(xiàn)象,實驗中在AC1非重疊區(qū)的2152位以及在IR5'區(qū)

8、的37位和59位多次被檢測到相同類型的突變,是否這些位點突變的變異體具有選擇優(yōu)勢還需進一步生物學驗證。對TYLCV在AC1-AC4區(qū)發(fā)生的堿基突變及由此引起的氨基酸突變分析結(jié)果表明,AC1區(qū)上的堿基突變,無論是在重疊區(qū)還是在非重疊區(qū),均為非同義突變,而AC4區(qū),突變均為同義突變。
　　 對采自不同時間及地區(qū)的TYLCV種群序列分析表明,各分離物的主序列差異較大,其中SD1種群的主序列在SX15種群中以突變體的形式出現(xiàn),由此推測,